牛膝多糖硫酸酯体外抗新城疫病毒活性研究.doc

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1、牛膝多糖硫酸酯体外抗新城疫病毒活性研究　　摘要：采用四甲基偶氮唑盐法检测牛膝多糖硫酸酯对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞的保护作用。结果表明，牛膝多糖硫酸酯体外抗ＮＤＶ的ＩＣ５０为０．２３ｍｇ／ｍＬ，治疗指数ＴＩ为５．３。所以在体外，牛膝多糖硫酸酯有较显著的抗ＮＤＶ作用。　　关键词：牛膝多糖硫酸酯；抗病毒活性；新城疫病毒　　中图分类号：Ｑ９５９．７４５．２；Ｑ５３９；Ｓ８５２．６５＋９．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11404－0794-02　　　　Ａｎｔｉ－ＮＤＶＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓbｉｄｅｎｔａｔａＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ

2、ｅＳｕｌｆａｔｅＩｎＶｉｔｒｏ　　　　ＬＵＧｕｉ－ｐｉｎｇ，ＣＡＩＢｉｎｇ－ｙａｎ，ＬＩＪｕ－ｙｉｎ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｎｔｉ－ＮＤＶａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｕｌｆａｔｅｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙＭＴＴ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ５０％inhibitionｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉ－ＮＤＶａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｎｄｅｘｏｆＡＢＰＳｗｅｒｅ０．２３ｍｇ／ｍLａｎｄ５．３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡＢＰＳｈａｓｏｂｖｉｏｕｓＮ

3、ＤＶｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｉｎｖｉｔｒｏ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｕｌｆａｔｅ；ａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ　　　　新城疫病毒引起鸡的新城疫，严重危害养鸡业的发展。多糖和多糖修饰物作为抗病毒药物的探索已成为近年来研究的热点［１］；其中牛膝多糖经硫酸酯化修饰成的牛膝多糖硫酸酯，已有报道认为其具有抗单纯疱疹病毒Ⅰ型［２］、抗艾滋病病毒［３］和抗乙型肝炎病毒［４］等作用。试验对牛膝多糖硫酸酯体外抗新城疫病毒的活性进行了研究，为寻求新的

4、有效抗新城疫病毒的药物提供理论依据。　　１材料与方法　　１．１材料　　１．１．１药物牛膝多糖硫酸酯购自浙江京新药业股份有限公司；将ＡＢＰＳ用细胞维持液做适当稀释，过滤除菌后备用。利巴韦林购自江苏方强制药厂，用细胞维持液稀释后备用。　　１．１．２病毒鸡新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８标准株，购自中国兽医药品监察所；按Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法测定其对培养鸡胚成纤维细胞的半数组织培养感染量为１．０×１０－４．７５，再用细胞维持液配制成每毫升100ＴＣＩＤ５０，作为试验用浓度。　　１．１．３细胞鸡胚成纤维细胞按照常规方法制备。　　１．１．４试剂培养基为Ｇｉｂｃｏ产品ＤＭＥＭ

5、，按照说明书将其溶解，调节ｐＨ值为７．２～７．４，微孔滤膜过滤除去杂质，加入１０％胎牛血清为细胞生长液，１％胎牛血清为细胞维持液，最后加入各１００Ｕ／ｍＬ的青霉素和链霉素；还有四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜、０．２５％胰蛋白溶液。磷酸缓冲液ＰＢＳ为自制。　　１．２方法　　１．２．１ＭＴＴ法检测ＡＢＰＳ对ＣＥＦ的毒性将制备好的ＣＥＦ用生长液调至１×１０６个／ｍＬ，接种于９６孔细胞培养板，１００μＬ／孔，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后取出，倾倒去生长液，用ＰＢＳ液洗２次，在单层细胞上分别加入浓度为０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０、１．６

6、０ｍｇ／ｍＬ的ＡＢＰＳ含药细胞维持液，１００μＬ／孔，每种浓度重复４孔，并设正常细胞对照组。培养７２ｈ后，弃培养液，每孔加入含５ｍｇ／ｍＬＭＴＴ的不含血清的ＤＭＥＭ５０μＬ，继续培养２ｈ后，弃ＭＴＴ上清，ＰＢＳ液洗３次，每孔加裂解液１００μＬ，振荡５～１０ｍｉｎ，待结晶完全溶解，酶标仪测５７０ｎｍ处的ＯＤ值［５］。按公式计算细胞存活率，并计算ＡＢＰＳ对ＣＥＦ的半数毒性浓度。ＴＣ５０为５０％细胞存活率所对应的ＡＢＰＳ浓度，单位为ｍｇ／ｍＬ，利巴韦林的细胞毒性测定方法同上。　　细胞存活率＝×１００％　　１．２．２ＭＴＴ法检测ＡＢＰＳ对ＮＤＶ感染ＣＥＦ的保护作

7、用取出培养２４ｈ后的ＣＥＦ，倾倒去生长液，用ＰＢＳ液洗２次，在单层细胞上加入１００ＴＣＩＤ５０的病毒液１００μＬ／孔，继续培养２ｈ后取出，然后分别加入０．１、０．２、０．４、０．８、１．６ｍｇ／ｍＬ的ＡＢＰＳ１００μＬ／孔，每种浓度重复４孔，同时设置正常细胞对照组、病毒对照和阳性药物对照组。置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养７２ｈ后，参照上述ＭＴＴ法测５７０ｎｍ处的ＯＤ　　值［６］。按公式计算ＡＢＰＳ对ＮＤＶ感染ＣＥＦ的抑制　　率，并计算ＡＢＰＳ对ＮＤＶ感染ＣＥＦ的半数抑制浓度。ＩＣ５０为５０％病毒抑制率所对应的ＡＢＰＳ浓度，单位为ｍｇ／ｍＬ，利巴韦林的细

8、胞存活率测定方法同１．２．１［５］。　　病毒抑制率＝　　×１００％　　并进一步计