测定方法-游离脂肪酸.doc

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1、2.1.4游离脂肪酸测定方法2.1.4.1试剂乙醇-乙醚混合溶液：无水乙醚与95%乙醚1：1（V）混合，每100mL溶剂加入0.3mL酚酞指示剂0.1MKOH标准溶液：称取5.8gKOH溶于1000mL新沸冷却蒸馏水中，摇匀，按下法标定其摩尔浓度。称取在125℃烘至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.8608g，精确至0.0002g，置于250mL锥形瓶中，以50mL蒸馏水溶解，加入2-3滴酚酞指示剂，用上述KOH溶液滴定至粉红色，同时做空白试验，KOH标准溶液摩尔浓度式中：G—邻苯二甲酸氢钾质量，gV—KOH溶液用量，mLV0—空白试

2、验KOH溶液的用量，mL0.2042—每mol邻苯二甲酸氢钾的质量,g计算结果：=1%酚酞指示剂：1g酚酞溶于100mL95%乙醇中2.1.4.2仪器250mL锥形瓶，25mL滴定管分析天平2.2.5游离脂肪酸（FFA）含量的测定[1]：精确称取样品5.0g，置于锥形瓶中，用水浴微热熔融，加入预先中和的乙醚、乙醇混合液50mL，使之溶解，加入1%酚酞5滴，然后用氢氧化钾标准溶液滴至呈粉红色，10s内不退色为终点，记录消耗氢氧化钾标准液的毫升数。游离脂肪酸质量分数(以油酸计)为式中FFA-游离脂肪酸的质量分数V-消耗氢氧化钾标准溶

3、液的体积（mL）C-氢氧化钾标准溶液的浓度（mol/L）282-油酸的摩尔质量（g/mol）m-样品质量（g）2.1.5游离氨基酸测定方法2.1.5.1试剂40%中性甲醛：40mL甲醛溶于60mL蒸馏水中，用1mol/LNaOH调pH为8.10.1%百里酚酞：0.1g百里酚酞溶于90mL乙醇，加水至100mL0.1MNaOH标准溶液：称取110gNaOH，溶于100mL无CO2的水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。用塑料管量取5.1m上层清液，用无CO2的水稀释至1000mL摇匀。称取0.75g于105-110℃烘

4、至恒重的邻苯二甲酸氢钾，加入无CO2水溶解，加2滴酚酞指示液，用配好的NaOH底至溶液呈粉红色，并保持30s，同时做空白实验。NaOH标准溶液的摩尔浓度式中:m—邻苯二甲酸氢钾质量，gV1—NaOH体积，mLV2—空白试验消耗NaOH的体积，mLM—邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量，204.22g/mol计算结果：==0.110262.2.6游离氨基酸（FAA）含量的测定：甲醛滴定法[8]吸取相同的2份样品溶液10.0mL，置于2只三角瓶中，各加50mL蒸馏水，50℃水浴萃取0.5h。其中1份加入中性红指示剂3滴，用标准氢氧化钠溶液(0

5、.1mol/L)滴定至琥珀色为终点，此时可用pH计测定其pH值为8.2。另一份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20ml,静置1分钟后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至淡蓝色，此时用PH计测定其pH值为9.2。游离氨基酸含量计算公式：式中FAA%-游离氨基酸的百分0.014-氮的毫克当量N-标准氢氧化钠的摩尔浓度/mol/LV1-中性红做指示剂时消耗氢氧化钠的体积/mLV2-百里酚酞做指示剂时消耗氢氧化钠的体积/mL2.8SDS凝胶电泳的测定样品的处理：样品处理液0.5mL（含浓缩胶缓冲液56%，甘油42%，SDS2%）与β-

6、巯基乙醇2-ME20µL，溴酚蓝20µL混合，加蒸馏水定容至1mL，混合均匀，将混合溶液倒入2mL的带盖的试样管中。将试样管放入沸水中加热5min（加强SDS与蛋白的结合），冷却到室温，于-20℃冷藏。SDS-PAGE电泳采用5%的浓缩胶和12%的分离胶，分别用0.125mol/LTris-Hcl（pH6.8）和0.38mol/LTris-HCl（pH8.8）进行配制，两者均含有0.1%SDS。电泳缓冲溶液含有0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸（Glycine），0.1%SDS。上样量为10μL。浓缩胶部分

7、的电流为100V，进入分离胶后，电流为150V。电泳结束后，将胶片固定4h（固定液含有33%甲醇和12%三氯乙酸）。然后染色3h（染色液含有0.9g，考马斯亮蓝G-250，1mol/L硫酸，10mol/LNaOH，12%TCA）。染色结束后，用水对胶片进行洗脱[94]。3.2.4测定方法3.2.4.1pH4.6SN测定[253]：准确称取0.75g干酪，加入25mLpH4.6的醋酸盐缓冲液，将干酪充分磨碎，再用25mL的缓冲液充分冲洗，悬浮液在4000rpm的离心机中离心20min，取上清液定量地移入凯氏消化瓶，进行微量凯氏定氮

8、，并以占干酪总氮量的百分数（%）表示。3.2.4.212%TCASN测定[253]：准确称取1.5g干酪，加入25mL12%的TCA溶液，将干酪充分磨碎，再用20mL的缓冲液充分冲洗，悬浮液在4000rpm的离心机中离心20min，取上清液定量地移入凯氏消化瓶，