利用油体蛋白体外重组技术实现牛肠激酶固定化应用.doc

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1、利用油体蛋白体外重组技术实现牛肠激酶固定化应用　　摘要：为研究利用油体蛋白体外重组技术实现肠激酶固定化应用的可行性，利用油体蛋白Ｏｌｅｏｓｉｎ、自剪切蛋白Ｉｎｔｅｉｎ和人工合成的牛肠激酶轻链ｃＤＮＡ，分别构建表达盒Ｉｎｔｅｉｎ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＥＫ和Ｉｎｔｅｉｎ－ＥＫ，插入毕赤酵母表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ，转化毕赤酵母ＧＳ１１５，甲醇诱导表达后通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测发现，带有Ｉｎｔｅｉｎ－肠激酶表达盒的阳性菌株中有目的蛋白的表达，而Ｏｌｅｏｓｉｎ－ｉｎｔｅｉｎ－肠激酶融合蛋白表达盒不能在酵母中表达。　　关键

2、词：油体蛋白；人工油体；肠激酶；固定化酶　　中图分类号：Ｑ５５６＋．９；Ｑ８１４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11404－0849-05　　　　ImmobilizedApplicationofBovineErokinaebyinVitroOleosin　　RecombinationTechnology　　　　ＤＯＮＧＬｉ－ｑｉａｎｇ１，２，ＬＩＭｅｉ２，ＺＨＡＮＧＹａｎ－ｙａｎ１，２，ＳＵＮＷｅｎ－ｌｉ２，ＣＨＥＮＨｏｎｇ－ｍａｎ１，ＬＩＵＹｕ－ｈｕｉ２　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉ

3、ｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｅｂｙａｒｔｉｆｉｃｉａｌｏｉｌｂｏｄｉｅｓ，ｔｗｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓ，ｏｌｅｏｓｉｎ－ｉｎｔｅｉｎ－ＥＫａｎｄｉｎｔｅｉｎ－ＥＫ，ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅ，ｉｎｔｅｉｎａｎｄａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＥＫｃＤＮＡｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓｗｅｒｅｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＰＩＣ９ＫａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＰｉｃｈｉａｐａｓｔ

4、ｏｒｉｓＧＳ１１５ｓｔｒａｉｎ．Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｍｅｔｈａｎｏｌ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｔｅｓｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ；ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｉｎｔｅｉｎ－ＥＫｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ，ｗｈｉｌｅｏｌｅｏｓｉｎ－ｉｎｔｅｉｎ－ＥＫｗａｓｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｌｅｏｓｉｎ；ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｏｉｌｂｏｄｉｅ

5、ｓ；ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅ　　　　肠激酶［１］是存在哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶，由两个亚基组成，分重链和轻链［２］，其中，轻链是全酶的催化中心，具有全酶的催化活性，能够识别并酶解专一性的氨基酸序列。肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，识别序列在脊椎动物中也有很强的保守性。又因其反应条件相对温和，非特异性切割率低，经ＥＫ裂解融合蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的Ｎ－末端氨基酸序列，因此在基因工程制药领域成为融合表达时下游纯化的首选工具酶之一［３］。　　Ｉｎｔｅｉｎ是具

6、有自我剪接功能的多肽，能将自身从前体蛋白中切除并催化其两侧的肽链形成肽键［４］。大部分Ｉｎｔｅｉｎ均具有蛋白质剪切活性和自导引核酸内切酶活性。结构Ⅰ由Ｉｎｔｅｉｎ的Ｎ末端和Ｃ末端，几乎均为β折叠，为剪切结构域；结构Ⅱ位于Ｉｎｔｅｉｎ内部，为自导引核酸内切酶结构域。自导引核酸内切酶活性是位点特异性的，在识别序列和功能上与核酸内含子的自导引核酸内切酶类似，可以在无Ｉｎｔｅｉｎ的等位基因的双链ＤＮＡ处定点切割，引起Ｉｎｔｅｉｎ的插入［５］，结构Ⅱ缺失可产生仅具有蛋白质剪切功能的Ｉｎｔｅｉｎ。ＮＥＢ公司根据以上的原理研发了ＩＭＰＡＣＴ－Ｃ

7、Ｎ蛋白表达和纯化系统，该系统以几丁质结合域［６］代替了Ｉｎｔｅｉｎ的结构Ⅱ，表达产生的ＩｎｔｅｉｎＣＢＤ融合蛋白可与几丁质柱特异结合，之后利用ＤＴＴ、半胱氨酸或ｐＨ值诱导Ｉｎｔｅｉｎ进行自我剪切，将目的蛋白从几丁质柱上切割下来，实现目的蛋白的分离和纯化。近年来，Ｉｎｔｅｉｎ介导的自我剪接系统还被广泛用于蛋白质靶向连接［７］、多肽环化［８］以及配体分子的定量测定等。　　植物种子中贮存的营养物质主要包括蛋白质、脂肪和碳水化合物。其中脂类物质一般以三酰甘油的形式存在，荷荷芭例外，它储存蜡酯。种子中的ＴＡＧ分子之间不是彼此聚合的，而是分散

8、成许多小的稳定的亚细胞微滴，被称为油体。根据Lioyd等［９］得出的油体结构模型，油体内部为液态ＴＡＧ，外部是由单层磷脂分子及其镶嵌蛋白―油体蛋白组成的半单位膜，这个半单位膜的基本单位是由１３个磷脂分子和１个油体蛋白分子组成。　　Ｏｌｅｏｓｉｎ是高