两种HBV—DNA核酸提取法对荧光定量PCR结果的影响-论文.pdf

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1、湘南学院学报(医学版)2014年3月第16卷第1期33两种HBV—DNA核酸提取法对荧光定量PCR结果的影响何志雄，李木兰，袁才佳，蒋显勇(1郴州市第一人民医院检验医学中心，2湘南学院预防医学与医学检验系，湖南郴州423000)摘要：目的比较免核酸提取法与煮沸裂解法对HBV—DNA提取后荧光定量PCR检测结果的影响。方法用两种前处理方法不同的试剂盒检测7．0×l02～7．0×1OIU／ml的HBV—DNA阳性标准品和84例临床小三阳患者血清，对结果进行重复性、相关性分析。并计算两种方法对低浓度HBV—DNA值的阳性检出率。结果阳性标准品HBV—DN

2、A浓度大于103IU／ml样本的均值两种方法比较，相关性良好(线性相关，r=0．993)，CV比较发现，免核酸提取比煮沸裂解的CV要小。临床小三阳患者84例HBV—DNA浓度在1～l03IU／ml的标本，免核酸提取法阳性检出率为25％高于煮沸裂解法的11．9％(P=0．015)。结论免核酸提取法操作简单，结果稳定可靠，线性范围宽，有益于乙肝病毒感染窗口期的早期诊断。关键词：乙型肝炎病毒；核酸提取；荧光定量PCR中图分类号：R512．62文献标识码：A文章编号：1673—498X(2014)01—0033—02doj：10．3969／j．issn．1

3、673—498x．2014．01．014乙型病毒性肝炎(viralhepatitistypeB)是危害我1．3实验方法国人民身体健康的主要疾病J。检测HBV—DNA1．3．1免核酸提取法试剂盒按照试剂盒的说明进是目前诊断和评价乙型肝炎治疗效果的最直接的指行操作：在0．5ml反应管内加5核酸裂解液，分别标之一，医疗单位已普遍开展HBV—DNA荧光定量人乙肝两对半为小三阳患者血清样本、质控品、标准PCR检测项目。核酸提取对HBV—DNA荧光PCR的品、阳性对照、阴性对照、临界阳性，各5，混匀放置结果有重要的影响J，经典的核酸提取方法，要经过10min后

4、，加PCR混合反应液4J0混匀，密封反应管核酸的裂解沉淀和纯化这两个主要的步骤，纯化的后低速离心10s，按试剂要求设置扩增条件，ABI7300DNA需转移到新的扩增试管，操作过程容易交叉污仪器上检测分析，仪器检测时间约1．5h。染且操作较为繁琐；免核酸提取法使样本中的HBV—1．3．2煮沸裂解法试剂盒按照试剂盒的说明进行DNA的裂解和扩增在一个试管内先后完成，裂解操作：在0．5mlEP管内加样本处理液I100，分别DNA后无需转移试管、加热、离心，操作简单。本实加乙肝两对半为小三阳患者血清样本、质控品、阳性验采用免核酸提取法与煮沸裂解法对不同浓度的

5、对照、阴性对照、临界阳性，各100充分震荡混匀HBV—DNA阳性标准品和84例临床小三阳患者血清后，13000转离心10min，弃去上清液留下沉淀后，加进行HBV—DNA荧光定量PCR检测，分析两种类型样品处理液II25l，充分震荡混匀后低速离心数秒，的核酸提取模式对血清中HBV—DNA荧光定量PCR100oC干浴10min，最后13000转离心10min，提取上检查结果的影响。清2l于加好PCR反应液的罗氏毛细管内，用Ught—Cycled．0荧光定量PCR仪器检测；按试剂要求设置1材料与方法扩增条件，仪器检测时间约40min。1．1研究对象1．

6、3．3重复性、相关性检查稀释HBV—DNA浓度取郴州市某三级医院肝炎定性检查确定阳性血为7．0×107IU／ml的标准品为7．0×lo7、7．0×lO6、清为实验对象，定性检测试剂由北京万泰生物有限公7．0×l05、7．0×lO4、7．0×lO0、7．0×1()21U／ml浓度，用司提供，筛选出的样本84例；由圣湘公司提供并倍比两种方法平行检测20次。荧光定量PCR检i贝4结果进稀释的乙肝病毒阳性标准品。行对数转换处理后进行比较，计算出两种方法不同浓1．2试剂和仪器度水平测定的CV值，比较两种方法的重复性差异，深圳匹基HBV—DNA荧光定量试剂盒与

7、罗氏公并对两种方法检测结果进行相关性分析。司提供的LightCyeler3．0荧光定量PCR仪；湖南圣湘1．3．4低浓度HBV—DNA标本的阳性检测率以临HBV—DNA荧光定量试剂盒与美国ABI7300荧光定床乙肝病毒定性检测为“小三阳”样本84例，用两种量PCR仪。方法同时检测，比较两种方法在低浓度HBV—DNA收稿日期：2013—12—03基金项目：湖南省精品课程项目(2009—252)；湘南学院十二五重点学科项目(XNUI25KD022)作者简介：何志雄，男，主管检验师。通讯作者：李木兰，女，讲师。34JournalofXiangnanUni

8、versity(MedicalSciences)Mar．2014Vo1．16No．1水平的阳性检出率。不同浓度水平的标准品