酵母双杂实验步骤.docx

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1、2.1.1酵母双杂交2.1.1.1Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC-AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-TAC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其

2、中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：attB-PCR产物（≥10ng/μL）1-7μLpDONR221(150ng/μL)1μLTEbuffer,pH8.0补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μLBP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mLKan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.

3、2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。进行BP反应时，需注意以下几项：(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。2.1.1.2诱饵载体构建重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母

4、双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：入门载体(50-150ng)1-7μLpDEST32(150ng/μL)1μLTEbuffer,pH8.0补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μLLR反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将LR反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选用含有50μg/mLGen抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度。LR反应注意事项：对于

5、LR反应来说，最高效的是超螺旋的入门载体和目的载体进行反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反而会提高反应的效率；为了提高LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于大于10kb的质粒非常有必要。2.1.1.1转化酵母细胞转化前需小量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：(1)将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30℃培养2天；(2)挑取酵母菌单克隆至10mLYPAD液体培养基中，30℃，230rpm过夜培养；(3)将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释至OD600为0.4左右，30℃，230rpm继续培养2-4h；(4)室温下2500rpm离心5min

6、收集菌体，弃上清，加入40mL1×TE（pH7.5）重悬；(5)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入2mL1×LiAc/0.5×TE重悬；(6)室温静置孵育10min；(7)立即用于下游的酵母小量转化实验。酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进行转化，通过以下步骤将组合载体转入酵母细胞中：(1)向每个1.5mL离心管中加入1μg质粒、100μg变性鲑鱼精DNA以及100μL酵母感受态细胞；(2)加入700μL的1×LiAc/40%PEG-3350/1×TE并上下颠倒混匀，30℃孵育30min；(3)加入88μL的DMSO，混匀，然后42℃热击7min；(4)在微量

7、离心机中瞬时离心10s，弃去上清；(5)加入1mL1×TE重悬菌体后瞬时离心，弃上清；(6)加入50-100μL1×TE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30℃培养2天。表3-2酵母转化组合Table3-2SetsofplasmidsusedinyeasttransformationassayLEU2PlasmidTRP1PlasmidPurpose1nonenoneNegativetransfo