酵母双杂交实验步骤.doc

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1、LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

2、质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoRI与XhoI)上游，含有SV40核定位(SV40nuclearlocalization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码

3、序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。二、商品化酵母双杂交系统的组成1.  载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2.  酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM

4、4271（EGY48的伴侣菌株）3.  大肠杆菌菌株：E.coliKC8株4.  对照质粒：质粒  用途pLexA-53，pB42AD-T  阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4AD融合蛋白〕  阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用)  假阳性检测质粒5.  引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。三、酵母双杂交实验的基本流程1.  将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。2.  同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3.  构建DNA-BD

5、/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。4.  将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。转化质粒  选择培养基  克隆生长情况  说明  (含有Gal/Raf)    pLexA-Pos  SD/-His，-Ura  蓝  阳性对照pLexA  SD/-His，-Ura  白  阴性对照PlexA-X  SD/-His，-Ura

6、  白  没有直接激活活性PlexA-X  SD/-His，-Ura  蓝  具有直接激活活性PlexA-X  SD/-His，-Ura  菌落不能生长  酵母细胞毒性4-1.  如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信号作用。b能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少4-2.  如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。5.  如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质

7、粒转化效率。转化  质粒  SD固体培养基  LacZ表型对照1  pLexA-Pos  Gal/Raf/-His/-Ura  蓝对照2  pLexA-53  Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu  蓝  ＋pB42AD-T    实验  pLexA-X  Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu  待测  ＋pB42AD-文库    5-1.  用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。-半乳糖苷酶无表达。b5-2.  上述重组子转至含X-gal

8、的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。