酵母单杂交 实验步骤总结

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1、1pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。（2）用TEbuffer溶解寡核苷酸至终浓

2、度100mmol/L。（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50mmol/L）。（4）95°C保温30s，去除二级结构。（5）72°C保温2min，37°C保温2min，25°C保温2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20°C冰箱备用。（7）酶切1mLpAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5mmol/L。（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi

3、载体（50ng/mL）1.0mLannealedoligonucleotide（0.5mmol/L）1.0mL10×T4DNAligasebuffer1.5mLBSA（10mg/mL）0.5mLNuclease-freeH2O10.5mLT4DNAligase（400U/mL）0.5mL总体积15mL注：如果有必要，可用1mLnuclease-freeH2O代替寡核苷酸作为阴性对照。（10）将反应体系室温放置连接3h，转化Ecoli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（

4、图）图3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1）用BstBI或者BbsI酶切2mLpBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。（2）按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步骤用1ml酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3d后挑取5个单克隆，用MatchmakerInsertCheckPCRMix1进行PCR检测阳性克隆，用

5、Y1HGold的单克隆做阴性对照。（4）在PCR管中加25mlPCR-gradeH2O。（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-gradeH2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。（6）向每个管中加入25mlMatchmakerInsertCheckPCRMix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25mlH2O/yeast25ml总体积50

6、ml（1）按下述程序进行PCR反应；95°C1min98°C10s55°C30s30cycles68°C2min（2）取5mlPCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4kb。图4PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35kb+insertsize（3）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30°C孵育3d后，将平板置于4°C保存，即为新

7、构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。（4）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用1mL预冷培养基（100ml灭菌的YPDA与50ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70°C保存。3检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结

8、合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑