抑制p70S6K对HSC-T6增殖活化的作用研究-论文.pdf

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1、·1062·安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Aug；49(8)抑制p70S6K对HSC—T6增殖活化的作用研究占书箱，黄成，马陶陶，陈培杰，李俊摘要目的研究抑制核糖体40S小亚基S6蛋白激酶蛋白(mammaliantargetofRapamycin，mTOR)的下游(p70S6K)的表达对大鼠肝星状细胞株(HSC—T6)增殖活化底物，研究显示，p70S6K在细胞增殖、生长中起到的影响。方法建立CC1诱导大鼠肝纤维化模型，观察磷重要的调控作用。该实验室前期研究表明，在血

2、酸化p70S6K在纤维化肝组织中的表达变化；利用雷帕霉素小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor，抑制p70S6K蛋白表达，及靶向p70S6K基因的siRNA预处PDGF)诱导HSC．T6增殖活化中，p70S6K的磷酸化理HSC．T6，再添加重组小鼠血小板衍生生长因子(PDGF—水平明显增加，表明p70S6K可能参与HSC的增殖BB)诱导，观察HSC—T6的增殖活化情况；利用Westernblot、活化。现利用雷帕霉素抑制p70S6K的表达，并通RT—PCR检测p70S6K、P．p70S6K、

3、IX-SMA、CollagenI的蛋白和过靶向p70S6K的siRNA抑制p70S6K的活化，探讨基因表达水平。结果CC14诱导大鼠肝纤维化模型组磷酸化p70S6K蛋白明显升高；雷帕霉素预处理HSC-T6，明显降p70S6K在HSC增殖活化中的作用。低了p70S6K的磷酸化水平，并抑制了PDGF-BB诱导的细胞1材料与方法增殖及—SMA、CollagenI的表达；siRNA转染HSC-T6，在基因和蛋白水平抑制了p70S6K的表达，同时减少了PDGF—BB1．1实验动物雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体诱导的一SMA、Col

4、lagenI,P·p70S6K的表达。结论用siR-重180—220g，清洁级，购于安徽医科大学实验动物NA和雷帕霉素阻断p70S6K的表达，在一定程度上可以抑中心。制HSC—T6的增殖和活化，为肝纤维化的防治研究提供新的1．2细胞株HSC．T6购自中国科学院上海细胞思路和靶点。库，为永生化大鼠HSC。关键词肝星状细胞株；p70S6K；siRNA；雷帕霉素；肝纤维1．3主要材料与试剂重组小鼠血小板衍生生长化因子(PDGF—BB)购于英国PEPROTECH公司；靶向中图分类号R322．47；R329．25；R575．202．2

5、p70S6KRNAi试剂盒购于上海吉玛公司；Lipo—文献标志码A文章编号1000—1492(2014)08—1062—06fectamine。M2000购于美国Invitrogen公司；雷帕霉素购于Aladdin公司；RabbitmAbanti—P—p70S6Kinase肝纤维化是各种病因所致慢性肝损伤后，实质(T389)购于美国CellSignaling公司；MousemAban—细胞再生、间质细胞活化增生和细胞外基质(extra．ti—o【．SMA购于武汉博士德生物工程有限公司；四甲cellularmatrix，ECM

6、)沉积的肝组织修复重建的过基偶氮唑蓝(MYr)购于美国Amresco公司；逆转录程，是慢性肝病共有的病理过程⋯。在肝纤维化的试剂盒购于日本TaKaRa公司；PCR试剂盒购于发生发展过程中，肝星状细胞(hepaticstellatecells，Fermentas公司；引物由上海生工公司设计合成；Op—HSC)的活化和增殖起关键作用，活化的HSC是过tiMEM、DMEM培养液、TRIzolReagentRNA提取试度沉积的ECM的主要来源细胞。因此，深入研究剂购于美国InvitrogenLifeTechnologies公司；胎牛

7、HSC活化增殖的机制，寻找抑制HSC活化增殖的方血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；DM—法，已受到国内外学者广泛的关注。核糖体40S小SO购于美国Sigma公司。亚基S6蛋白激酶(p70S6K)是哺乳动物雷帕霉素靶1．4主要仪器NAPCO-6100型细胞培养箱，美国2014—03—2O接收SHELLAB；SW-CJ—IF型超净工作台，江苏苏净集团基金项目：国家自然科学基金(编号：81072686、81202978)；安徽省高苏州安泰空气技术有限公司；PCR扩增仪，德国等学校省级自然科学研究项目(编号：KJ2010A16

8、2)；安徽Eppedorf公司；Westernblot设备，美国Biorad公司；省自然科学基金重点项目(编号：KJ2012A156)Sigam3-16K高速离心机，美国Sigma公司；冷冻离心作者单位：安徽医科大学药学院，合肥230032机TGL．18R，珠海黑马医学仪器有限公司；酶标仪