噬菌体展示肽库技术淘选蚕丝纤维蛋白连结短肽的实验研究.pdf

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1、第39卷第1期西南民族大学学报·自然科学版。JournalofSouthwestUniversityforNationalities·NaturalScienceEditiondoi：10．3969~issn1003-427120130105噬菌体展示肽库技术淘选蚕丝纤维蛋白连结短肽的实验研究戴静，李涵依，全亚玲，欧小兵，陈艺元，郝葆青(西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041)摘要：采用噬茵体随机肽库展示技术研究与蚕丝纤维蛋白连结的功能性短肽的淘选方法．实验结果显示，淘选的与蚕丝纤维蛋白连结的功能性短肽都包含有一个相同的氨基酸残基序列QSWS．噬茵体与蚕丝蛋白的连结

2、试验和合成肽与蚕丝蛋白的连结试验都证实了QSWS序列与蚕丝蛋白连结的重要性．随着对淘选方法进一步改进和优化，这些功能性短肽将有助于对蚕丝进行功能化改造，可拓宽蚕丝在生物材料领域中的应用．关键词：噬菌体展示肽库技术；短肽；蚕丝蛋白；肽库；蚕丝中图分类号：R3l8．08文献标识码：A文章编号：1003-4271(2013)01．0017-041引言蚕丝是由蚕丝蛋白和丝胶蛋白组成，是最古老、最常用的生物材料之一，如已使用许多世纪的医用缝合线等．蚕丝不仅具有良好的生物相容性和生物降解性，而且容易加工成各种形态，如纤维，纱线，织物，海绵状和薄膜等【JJ．目前，蚕丝生物材料在现代生物医学

3、中的应用正在加速的发展，比如组织工程的基质材料等J．为了拓宽蚕丝的应用领域，还需对蚕丝分子功能及其特性进行较为详细的研究．早期对蚕丝材料分子功能和化学特性的研究大都仅涉及到各种反应试剂与蚕丝蛋白的共价化学修饰方面【jJ．2000年Mori等报道了有关蚕丝蛋白的基因修饰方面的研究．然而，这些基因修饰作用仍受限于宿主蚕遗传基因编码蛋白以及一些对宿主蚕无害基因编码蛋白的影响．近些年，各种生物分子技术如短肽标记技术的应用受到广泛关注．比如，短肽能以非共价键结合方式与一些可反映蚕丝新特性的功能性亚基(例如蛋白质，有机分子或纳米粒子)融合．因而，可利用噬茵体肽库的亲和性淘选将这些与外壳蛋

4、白融合的随机短肽展示或标记出来，这是一种有效发现各种功能性短肽配基的策略pJ．Sarikaya等认为许多短肽配基对无机或有机材料各种分子以及各种生物分子都具有亲和性．本文研究了噬菌体展示随机肽库技术淘选蚕丝纤维蛋白连结短肽的方法，并对所淘选的几个短肽配体进行了克隆、测序、合成、比较和分析．2材料与方法2．1蚕丝脱胶家养蚕茧由蚕农(成都，新津)提供．脱胶方法选用标准的脂肪酸盐／苏打法，即将蚕茧放入到含有0．08％(w／v)Na2CO3andO．2％(w／v)马赛皂液(橄榄油皂液)中进行脱胶，98~C，轻柔搅动1h．脱胶后纤维蛋白用温蒸馏水漂洗lOmin，然后在温和的条件(O．0

5、6％Na2CO3和0．15％马赛皂)下重复进行上述脱胶过程两次．最后，将脱胶后的纤维蛋白用温蒸馏水反复冲洗10rain，用冷水漂洗，在室温下用吸水纸上吸除多余水分，备用．收稿日期：20l2．12．17通讯作者：郝葆青(1956-)，男，教授，博士．E-mail：baoqhao~jgmail．corn．资助项目：西南民族大学研究生“创新型科研项目”18西南民族大学学报·自然科学版第39卷2．2蚕丝蛋白结合噬菌体的淘选与鉴定选购M13噬菌体随机12肽库(NewEnglandBiolabs产品，100ul，1．5×10pfu／ml，复杂度～2．7×10个转化子，贮存于含50％甘油的

6、TBS溶液中)用于肽的筛选，即噬菌体随机l2库肽与次要外壳蛋白Pill融合的展示．E．coliER2738宿主菌(NewEnglandBiolabs产品)用于噬菌体的扩增和鉴别．将干燥脱胶的蚕丝纤维蛋I~(10mg)放入到旋转过滤柱中，加入500gl0-1％TBST(50mmolTris／HClpH7．5，150mmolNaC1，0．1％V／VTween-20)缓冲液，离6,(-1，000~g，10S)洗脱．在室温下将噬菌体随机肽库(滴度约为1．5×10“pfu)和500gl0．1％TBST加入到上述旋转过滤柱中，孵育90rain(见表1)．孵育后用1mlO．1％TBST洗脱

7、、离6,(-1，000~g，10s)．连接有噬菌体的纤维蛋白保留在旋转柱中，而未连接有噬菌体的纤维蛋白则被离心去除．用含lmg小牛血清蛋白的1ml0．2M甘氨酸FHC1缓冲液(pH2．2)孵育连接纤维蛋白的噬菌体5rain．然后离心(除去纤维蛋白)，收集含噬菌体(称短肽噬菌体)的上清液，洗涤5次．最后，加入150gl1MTris／HCI(pH9．1)进行中和，即完成第一轮筛选．同样步骤进行第二、第三轮的筛选，条件见表．1．将每轮得到噬菌体感染E．coliER2738宿主菌进行扩增、滴度值测定(根据生产商