反义寡核苷酸干涉家蚕非编码RNA的研究.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci．2013，41(19)：8441—8442责任编辑朱琼琼责任校对卢瑶反义寡核苷酸干涉家蚕非编码RNA的研究刘宗才，黄蕾，阚云超，李丹丹(中英．南阳洛桑昆虫生物学联合实验室，河南南阳473061)摘要[目的]研究反义寡核苷酸干涉家蚕非编码RNA表达的情况。[方法]构建Bm一15的反义寡核苷酸探针，通过脂质体转染昆虫Si9细胞干涉Bm一15的表达。[结果]转染后细胞中Bm一15的表达量下降了63％，差异达显著水平，表明反义寡核苷酸探针对Bm．15基因表达有较好的抑制作用。[结论]该研究为进一步研究非编码RNA的功能奠定了良好

2、的基础。关键词家蚕；反义寡核苷酸；非编码RNA中图分类号S188文献标识码A文章编号0517—6611(2013)19—08441—02StudyOilInterferenceofNon．codingRNAsbyAntisenseOligonucleotidesinSilkwormLIUZong—caietal(China—uK—NYNU—RResJointLibratoryofInsectBiology，NanyangNormalUniversity，Nanyang，Henan473061)Abstractl0bjectivefTheaimWaStostudytheinterf

3、erenceofnon—codingRNAsbyantisense0Iigonucleotides(AS0)insilkworm．『Meth—od]TheASOprobeofBm15wasdesigned，andtransfectedtoS19cellsbyliposometointerferencetheexpressionofBm．15．fResult1TheexpressionofBm一15decreasedby63％afterASOtransfection．andthedifferencereachedsignificantleve1．whichshowedthatthe

4、ASOprobehadgoodinhibitoryeffectonBm．15geneexpression．1ConclusionII1hestudylaidagoodfoundationforthefurtherstudyonthefunctionofnon—codingRNAs．KeywordsSilkworm：Antisenseolig0nucle0tides；Non—codingRNAs随着人类基因组计划的完成和哺乳类转录组数据的不究奠定理论基础。断积累，越来越多的数据表明人类和其他高等真核生物的遗1材料与方法传物质只有极小部分会编码蛋白质⋯，而超过97％的转录产1．1材料

5、所用细胞系为实验室保存的昆虫Sf9细胞系。物是功能多样的RNA分子，即非编码RNA(non—codingGrace培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，脂质体(Invitro—RNA．ncRNA)。ncRNA可定义为一大类无蛋白质编码产gen)，Trizol(Invitrogen)；倒置显微镜，荧光定量PCR仪(Bio物但功能多样的RNA分子。它们通过RNA—DNA／染色—Rad)。质、RNA／RNA和RNA／蛋白质相互作用等方式参与到转录1．2细胞转染转染前1天将待转染细胞用适当密度接调节、染色体复制、RNA加工与修饰、mRNA的稳定性与翻译种于24孔板中(共接8孔，1

6、ml／~k)，28℃培养。用脂质体及蛋白质降解与转运等重要的生命过程中。。携带终浓度为5Onmol／L的ASO转染St9细胞，置于28cjC培反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ASO)技术，是指养5h。吸出转染液，加人正常的含10％胎牛血清的Grace根据碱基互补配对原理，用人丁合成的与靶标mRNA互补配培养基200，28oC培养48h后，用倒置荧光显微镜检测。对的DNA或RNA．导人生物体内，从而抑制靶标mRNA表达1．3荧光定量PCR(real-timePCR)所用Bm一15上下游的技术J。反义寡核苷酸技术特异性强，作用敏感迅速，可引物分别为：5

7、一TrCAATGATGATACAATGCT一3，5一AAAT—专一抑制靶基因表达，为基因结构和功能的研究提供了一种TCAGCCATCCAAGGA．3；内参基因为u6，上下游引物分别有用的工具。为：5一CTAAAATFGGAACGATACAG一3，5一A邢rGCGTGT—家蚕是人类最早驯化的动物之一，其作为鳞翅目模式生CA—TCCTF一3。荧光定量PCR条件为：95℃10min；9515物的同时，在研究昆虫变态发育及农林业害虫防治中也发挥S，95℃30S，7230S，40个循环，熔