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《绿色荧光蛋白的结构_发光机制及其应用研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、第46卷第2期武汉大学学报(自然科学版)Vol146No122000年4月J.WuhanUniv.(Nat.Sci.Ed.)Apr.2000,211～214文章编号:025329888(2000)0220211204综述绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究X0刘祖强,胡敏,齐义鹏(武汉大学生命科学学院病毒研究所,武汉430072)摘要:源自水母的绿色荧光蛋白作为生物标记物有其独特优点1近年来的研究揭示了其结构、发光特性和发光机制,并使之广泛应用于生物学的各个领域1关键词:绿色荧光蛋白;生物标记;应用中图分类号:Q789文献标识码:A[2]
2、生物发光现象在自然界并不鲜见1人类对生物等利用点突变使Ser65突变为Thr65,结果荧光发光现象的研究也由来已久1近年来,从水母强度比野生型增加4～6倍,吸收波长和发射波长分[3](Aequoreavictoria)中分离纯化的绿色荧光蛋白别增至490nm和510nm1Crameri等用DNA改(GreenFluorescentProtein,GFP),由于其作为生组(DNAshuffling)获得一个荧光强度比野生型大物标记物的独特优点,受到众多学者的青睐,得到广42倍的突变体1泛的研究和应用12绿色荧光蛋白的生色基团1绿色荧光蛋白的发光
3、特性GFP的生色基团由位于第65～67位的3个氨绿色荧光蛋白(GFP)是从水母分离出的一种天基酸:丝氨酸2脱水酪氨酸2甘氨酸形成的对羟基苯3然荧光蛋白1分子量约27×10,为一个由238个氨咪唑啉酮(42p2hydroxybene252imidazolinone)构成基酸残基组成的单链多肽1其荧光发射峰在509(图1)1GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的[4]nm,最大激发波长为395nm,并在470nm处有一结果1Heim等发现重组GFP的发光特性需在有肩峰1GFP的化学性质相当稳定,其变性需在90℃分子氧存在的环境下才能出现1推测其生
4、物合成过或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6molöL盐酸程如图1所示1[5]胍处理1Cubitt等认为生色基团自身环化的驱动力来[1][6]Chalfie等于1994年率先在大肠杆菌和线虫自蛋白质三维结构的形成,由此Kolb等提出一个中表达GFP,随后在酵母、果蝇、Hela细胞、植物、转假说,即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行1基因鼠、昆虫细胞等中表达成功1这些研究表明GFP被包含体捕获后即完全失去形成生色基团的GFP的生色基团(Chromophore)在异源细胞中可自能力,因为此时新合成的GFP不可能正确折叠1发形成,其发光无需任
5、何特殊的辅助因子参加1为了确定GFP荧光发射中需要分子的哪些部[7]GFP有两个缺点:1)有两个激发峰影响了其特分,Dopf等构建了GFPN2末端和C2末端部分缺异性;2)长波激发峰强度较小,不易观察1Heim失的表达载体1通过表达和检测发现,GFP的X收稿日期:19992122070通讯联系人基金项目:国家攀登计划(85231201204)和”九五”攻关项目资助(952001202204)作者简介:刘祖强(19722),男,硕士研究生,现从事分子病毒学研究1212武汉大学学报(自然科学版)第46卷图1GFP生色基团化学结构及其生物合成示意图
6、2～232个氨基酸对维持发光特性是必需的1截短生成的1C2末端7个以上氨基酸或N2末端两个以上氨基酸,生色基团位于螺旋中部,距桶状结构的几何中[2]则荧光全部丢失1但Heim等的研究表明去掉了心不到0.2nm,在其周围是极性和非极性的氨基酸C2末端12个氨基酸的GFP基因与HCVCore抗原侧链1Phe64和Phe46在生色基团附近将Trp63与基因融合,融合蛋白的荧光光谱与强度均无变化,最生色基团分开,使生色基团得到保护1[8]大发射波谱变宽(490～510nm)1岳莉莉等将C2末端的环状结构位于桶状结构外,其最后的GFPS65TC2端分别
7、截短12个氨基酸和75个氨基约7个氨基酸呈无序排列1这些氨基酸残基不形成酸,发现截短12个氨基酸时,对荧光特性无明显的“桶片”,故其缺失不影响荧光特性1N2末端是桶状影响1但截短75个氨基酸后,激发波长更短(360结构末端的“帽子”,故其缺失会引起荧光的丢失1nm),荧光微弱1她们表达的GFPöHBVe抗原和GFPöHCVc抗原两种双功能融合蛋白的荧光特性4绿色荧光蛋白的发光机制[2]与Heim等的结果一致1[11]Youvan等提出了GFP荧光发生机制的简3绿色荧光蛋白的结构单模型1这个模型中,在高pH或在生色基团附近引入突变时,假定Tyr
8、66处于酚盐形式;在低pH[9]下,则处于酚羟基形式(图2)1Yang等的研究表明,GFP是由两个相当规则的内含一个A2螺旋和外面包围11个B2折叠链的B2桶状结构
