电泳和色谱分离技术(应用)

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1、第6章蒸发电泳分离技术讲授人:李彩虹内蒙古工业大学概述——过程特点第一节．电泳基本概念1、电泳是指带电荷的供试品(蛋白质、核甘酸等)在惰性支持介质中(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)在电场作用下向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。电泳技术是实验室中分析、鉴定和分离技术之一。概述——过程特点第一节．电泳基本概念2、电泳分类：概述——过程特点第二节电泳分离基本原理带电粒子在电场中产生定向迁移，引起其迁移所受力（F)与电场强度(E)和粒子所带净电荷

2、（Z)成正比:粒子在电场中所受力与溶液黏度、分子半径、及稳态下移动速度有关各种不同分子量的蛋白质在电场内迁移速率与它的净电荷数成正比，而与其分子半径及溶液黏度成反比。实验证明，蛋白质的电泳迁移速率与蛋白质分子量的对数成线性关系根据此性质，可对具有相同电荷，不同分子量的蛋白质进行分离。电泳技术分类影响电泳迁移率的因素①电场强度。电场强度是指单位长度(cm)的电位降．也称电势梯度。根据电场强度不同，将电泳分为常压电泳(2-10V/cm)和高压电泳(20-200V/cm)。电场强度高，带电质点的迁移率加速，因此省时，但会产生大量热量。②溶液的pH

3、值。溶液的pH值决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。对于带有两性基团的电解质，溶液存在一pH值，此时，溶液所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，在电场中不再移动，这一pH值称为电解质的等电点（isoelectricpoint,PI)。若溶液pH值处于等电点酸侧，即pH＜pI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动；若溶液pH值处于等电点碱侧，即pH＞pI，则蛋内质带负电荷,向正极移动。溶液的pH值离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。③溶液的离子强度一方面，电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。

4、带电质点吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成一个与运动质点电荷相反的离子氛(ionicatmosphere),离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。另一方面，离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。④电渗。在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(electro—osmosis)。由于电渗的影响，质点迁移的表观速度不同于其固有速度。因固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持

5、物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，而与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表观速度比其固有速度要快；若质点原来移向正极，表观速度比其固有速度要慢。因此．应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。电泳的技术问题和对策：影响迁移速率的主要因素（1）各组分的分子净电荷数;(2)分子量;(3)电泳系统介质的有效黏滞度。（1）一般控制溶液pH4.5-9.5范围内。（2）选择适当的缓冲系统。（3）表面活性剂（4）控制电泳系统介质的有效黏滞度（5）电泳过程的产热问题A、蛋白质变性;B、引起区带扩散

6、，降低分辨率。最常采用的办法是将电泳产生的热量从电泳系统中移出，保持电泳温度恒定。概述——过程特点第11章色谱分离过程色谱法指多种成分的混合物，由于在流动相和固定相中有不同的分配，在流动过程中，经多次分配后而获得分离。同其他传统分离纯化方法相比，色谱分离过程具有如下特点。1、应用范围广2、分离效率高3、操作模式多样4、高灵敏度在线检测概述——过程特点色谱分离过程的基本原理色谱分离过程的实质是溶质在不互溶的固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等差异而使不同的溶质分离。即混合物中各个组分

7、按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱而得到分离。概述——过程特点固定相色谱柱填料分为球形颗粒填料和不规则形状颗粒填料。具有较高的机械强度，不易破碎，柱的填装重视性好，并可增加样品在柱中的渗透性。色谱分离过程常用柱填料有以下几种。（1）硅胶衍生的固定相;（2）活性炭;（3）离子交换树脂;（4）大孔吸附树脂;（5）凝胶;（6）手性固定相.概述——过程特点色谱柱及柱技术色谱柱是色谱技术的核心，色谱柱的性能依赖于三个因素：色谱柱填充技术、柱设计和生产。（1）色谱柱填装方法概述——过程特点（2）色谱柱设计以使被分离物质以“面进样”而不是“点进样”

8、的方式分布在柱头截面上，形成平整的活塞流，减少谱带扩张。概述——过程特点色谱的分类1、按两相状态分类按流动相状态分类气相色谱（GC);液相色谱（LC);超临界流体色谱（SFC)。