生殖克隆技术和干细胞工程

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1、人胚胎干细胞研究进展南京医科大学组织胚胎教研室江苏省生殖医学重点实验室周作民干细胞的基本概念胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞研究的进展情况胚胎干细胞的研究意义胚胎干细胞研究的困难及解决办法人体发生过程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子合子卵裂球桑椹胚囊胚滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层体表结构；神经系统干细胞的基本概念1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。2、分类：（1）

2、全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。横向分化：部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；永生化(immortal

3、)；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程；胚胎干细胞的性质胚胎干细胞系的建立过程1、干细胞来源：(1)发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞(2)从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（embryonicgerminatecells）(3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞（embryonalcarcinoma,EC)(4)生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT）去核卵细胞+体细胞核克隆囊胚分离内细胞群ES细胞2、胚胎干细胞的分离酶消

4、化后培养免疫方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法3、培养条件：(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化。4、胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞具有以下特点：(1)细胞内碱性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高(3)不被Hoechst33342和Rhodamine123染色(4)细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81(5)能分化成三个胚层的细胞，将胚胎

5、干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6)可诱导分化为各种成体干细胞干细胞特性干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达造血干细胞的鉴定：（1）细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小（2）细胞表面标志：flk-1（FetalLiverKinase1);L/TAL-1；CD3

6、4；GATA-1；（3）基因表达：TAL-1；GATA-2；βH1；β主要珠蛋白内皮细胞:（1）细胞形态：扁平贴壁状态；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡（2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3；CD34；JAM(JunctionalAdhesionMembrane)；MECA-32以及MEC-14，7抗原（3）特异基因表达：flk-1；flt-1；tie-2心肌干细胞：（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗

7、丝和细丝（2）细胞功能：节律性收缩；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If（3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链神经干细胞:（1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突（2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体（3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），

8、NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志）（4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和GluR-6，递质合成酶T