如何查找基因及设计因为,pcr

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1、基因查找，引物设计及Real-timePCR庄群川2013.11.18Partone---如何查找基因序列、mRNA序列Parttwo---引物设计Partthree---Real-timePCR原理及应用Partfour(Discussing)------从发现到分析,再到应用解决（临床问题）Partone---如何查找基因序列、mRNATherelationshipofDNA,RNA,mRNA,cDNA,Protein遗传学中心法责:DNA--RNA--PROTEIN!mRNA逆转录成为CDNA总RNA包括tRNA,mRNA,snRNA,rRNA等1.DNA是细胞核中的双螺旋结构脱

2、氧核糖核酸链，储存着遗传信息。DNA包括内含子，外显子。2.由DNA转录出各种RNA，RNA是单链的核糖核酸链。RNA包括mRNA，tRNA，rRNA，ncRNA。(ncRNA是nonecodingRNA的简称，包括miRNAsnRNA,snoRNA,scRNA,tmRNA等。)3.mRNA从DNA转录出来后还要剪切掉内含子才可用来翻译蛋白质。4.mRNA经反转录得到的DNA成为cDNA，因为cDNA没有内含子，所以和最初转录出mRNA的DNA不一样。NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)http://www.ncbi.nlm.n

3、ih.gov/mRNAmRNA同一个基因，可能存在不同的isoforms,mRNA序列有所不同，若没有特别要求，只需扩增到该基因的话，PCR引物可以选择扩增几个不同序列的公共保守区的序列。Parttwo---引物设计参考影响因子高的文献上的引物序列或好的网站上的（注意种属！）自行引物设计（软件）普通PCRReal-timePCR厂家设计合成（eg:Taqman探针法）普通PCR设计软件Real-timePCR设计软件PrimerPremier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），

4、引物设计窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能。打开程序首先进入的是序列编辑参看这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。PRIMER

5、PREMIER能即时分析引物二级结构在左下的两排按钮可以显示发现了哪些二级结构而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构除了二级结构图框里也显示二级结构的自由能数值G单位kcal/molEditPrimer引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列。进行粘贴时Paste粘贴窗口会激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑发生变化Analyze按钮就可以使用点击Analyze按钮即可分析编辑后的引物。AutomaticSearch自动搜索参考影响因子高的文献上的引物序列或好的网站上的（注意种属！）自行引物设计（软件）普

6、通PCRReal-timePCR厂家设计合成（eg:Taqman探针法）Real-timePCRRealtimePCR使用SYBRDye的话，对PCR产物的特异性要求非常高。非特异产物主要是引物二聚体，它的多少可能决定了本实验的检测灵敏度。熔点曲线和电泳可以检测引物二聚体。SYBR与所有dsDNA结合，包括引物二聚体（PrimerDimers），这就会使结果偏大。如何消除引物二聚体并提高灵敏度？理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与“变性，退火，延伸”完全吻合，使得PCR过程中产生极少引物二聚体，极少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。（1）设计适合R

7、ealtimePCR的引物。AppliedBiosystems公司建议用PrimerPress软件来专门设计realtimePCR引物。一些常见的基因引物序列可以借鉴其他成功的研究者。（2）除了寻找合适的序列，还可以改变退火温度，限制引物的浓度。（3）减少配试剂到开始反应之间的非特异扩增。（缩短时间+冰上操作）（4）PCR使用热启动酶，UNG酶。Partthree---Real-timePCR原理及应用游离时无荧光信号和DNA双链结合时