温热刺激对bcr／abl融合基因阳性的慢性粒细胞白血病细胞gp96转录水平的影响.pdf

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1、７８军事医学　２０１４年１月第３８卷第１期ＭｉｌＭｅｄＳｃｉ，Ｖｏｌ３８，Ｎｏ１，Ｊａｎ，２０１４　温热刺激对bcr／abl融合基因阳性的慢性粒细胞白血病细胞gp96转录水平的影响１１１２高炳华，袁小飞，张斌，王新生［摘要］　目的探讨温热刺激对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因阳性的慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）细胞ｇｐ９６转录水平的影响，为ＣＭＬ热疗研究提供理论基础。方法通过骨髓涂片对初选患者进行诊断，荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术检测ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，采集病例血细胞分为４组，对照组采用３７℃温

2、热刺激３０ｍｉｎ，试验组分别经４０℃、４２℃、４４℃进行温热刺激各３０ｍｉｎ，采用ＲＴ-ＰＣＲ技术检测ｇｐ９６ｍＲＮＡ的转录水平。结果骨髓涂片表现为ＣＭＬ骨髓像，ＦＩＳＨ检测ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因阳性。温热刺激后，随着刺激温度的提高，ｇｐ９６的转录水平也升高。结论在ＣＭＬ病例中开展热疗，可能通过ｇｐ９６参与的机体免疫调节，有助于病情的缓解。［关键词］　慢性粒细胞白血病；ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，ｇｐ９６，热疗［中图分类号］　Ｒ７３３．７［文献标志码］　Ａ［文章编号］　１６７４-９９６０（２０１４）０１-００７８-０２　　　　　　　D

3、OI：１０．７６４４／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４-９９６０．２０１４．０１．０２２慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）是水。参照ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因检测试剂盒说明及文献［２］进行一种发生在早期多能造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病，其操作。探针处理：每份标本加探针、杂交缓冲液混匀，滴至玻分子生物学特征是存在ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因。ｂｃｒ／ａｂｌ融合基片的待杂交处，盖上盖玻片，封片。将玻片放至湿盒，置７８℃因表达的ｐ２１０ｂｃｒ／ａｂｌ融合蛋白具有异常活跃的蛋白酪氨水浴锅预温５ｍｉｎ，移至４２℃培养箱杂

4、交过夜；洗片，复染，放酸激酶（ＰＴＫ）活性，可激活多条信号转导通路，导致造血细入４℃冰箱中１０ｍｉｎ左右，荧光显微镜观察。胞过度增殖，抑制细胞凋亡。热疗（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）通过增强Ｔ1．4ＲＴ-ＰＣＲ检测ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因阳性ＣＭＬ细胞ｇｐ９６淋巴细胞、Ｂ淋巴细胞以及ＮＫ细胞的抗肿瘤活性，增强机ｍＲＮＡ的转录［１］体免疫监视功能，是肿瘤综合治疗的手段之一。本实验采采集每例ＦＩＳＨ技术检测ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因阳性患者血用温热处理ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因阳性ＣＭＬ细胞，探讨温热刺激液８ｍｌ，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液获取

5、单个核细胞，对ＣＭＬ细胞ｇｐ９６转录水平的影响。为ＣＭＬ的热疗研究提ＰＢＳ冲洗离心后，加入４ｍｌＰＢＳ，吹打混匀，平均分装于４个供理论基础。试管。１个试管用于对照组，采用３７℃恒温水浴箱中热刺激1材料与方法３０ｍｉｎ；另外３个试管为实验组，分别置于４０℃、４２℃、４４℃恒温水浴箱中热刺激３０ｍｉｎ，离心收集细胞。使用总ＲＮＡ1．1主要材料与试剂提纯试剂盒提取各组总ＲＮＡ，用７５６紫外分光光度计测定样骨髓标本和血液标本均采集于我院血液科收治的初诊品D２６０和D２８０值，检测总ＲＮＡ纯度。采用ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为引ＣＭＬ患者共８例

6、，本研究获得了患者的知情同意，符合医学物进行反转录，获得ｃＤＮＡ。反转录条件：３７℃６０ｍｉｎ，９５℃伦理学及相关法规要求。ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因检测试剂盒购自５ｍｉｎ，４℃５ｍｉｎ，然后进行ＰＣＲ反应。引物序列：ｇｐ９６：上北京金菩嘉医疗科技有限公司，总ＲＮＡ提纯试剂盒和ＴＷＯ-游：５′-ＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡ-３′，下游：５′-ＣＴＧＧＡＴＧ-ＳＴＥＰＲＴ-ＰＣＲＫｉｔ购自北京赛百盛基因技术有限公司，引物ＧＡＣＧＴＧＴＡＧＡＡＧＴ-３′；β-ａｃｔｉｎ上游：５′-ＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣ-由北京赛百盛基因

7、技术有限公司合成。ＣＣＣＡＧＣＣ-３′，下游：５′-ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧ-３′。1．2骨髓涂片检查ＰＣＲ反应条件：９４℃３０ｓ，６０℃４５ｓ，７２℃９０ｓ，循环３０次；患者局麻后于髂后上棘行骨髓穿刺术，抽取骨髓，制作７２℃延伸７ｍｉｎ。２％琼脂糖凝胶电泳，黑马凝胶图像分析系骨髓涂片。骨髓涂片采用Ｗｒｉｇｈｔ-Ｇｉｅｍｓａ染色，光学显微镜统测定各条带灰度值；每组β-ａｃｔｉｎｍＲＮＡ随机采集１０次数观察，进行诊断。据，求取平均值作为每组β-ａｃｔｉｎｍＲＮＡ的平均灰度值；每组1．3荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术检

8、测ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因ｇｐ９６ｍＲＮＡ随机采集１０次数据，以公式ｇｐ９６ｍＲＮＡ相对含穿刺抽取５ｍｌ骨髓，肝素抗凝，新鲜配制的甲醇∶冰醋量＝ｇｐ９６ｍＲＮＡ灰度值／β-ａｃｔｉｎｍＲＮＡ的平均灰度值，求酸（３∶１）固定液进行固定，制备细胞滴片，老