2蛋白组学-二维电泳1

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1、蛋白质组学浙江大学生命科学学院江辉zhedajianghui@163.com密码：shenghua蛋白质组学研究思路和技术二维电泳质谱技术生物信息学第二章二维电泳与蛋白质分离一、蛋白质的提取与样品制备二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三、胶上蛋白质检测技术一、蛋白质的提取与样品制备从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程意义蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要无完全通用技术（技术和大量经验的结合）包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）分离：生物样品提

2、取液中的蛋白质与其它大量杂质分开提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品（如亲和纯化等）二维电泳分析中的样品制备（目标蛋白在细胞中的存在方式）稳定性（热、pH、蛋白酶、化学试剂等）丰度定位（膜、细胞质、细胞器等）溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）分离难易程度制备变性、活性蛋白二维电泳分析中的样品制备制备原则：尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。（2）不同类型的蛋白质需要不同

3、的方法（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过37°C，以防蛋白质氨甲酰化）。破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、独立的肽链样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80°C，不要反复冻融样品。完全去除样品中的核酸和某些干扰

4、蛋白。通过超速离心清除所有的杂质。主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。蛋白质制备流程分离、提取、纯化分离：组织或细胞破碎最大程度的细胞破碎最小程度的蛋白水解或降解提取：分离或沉淀蛋白质（可选择）去除杂质（除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等）冷冻干燥、沉淀（TCA、丙酮）等纯化：去除无关杂质（可选择）反复提取分级提取样品类型整体样品：单细胞微生物、微生物混合菌等组织样品：器官（

5、肝脏）、植物组织（根、叶）等细胞（细胞器）样品：培养细胞、分离细胞、细胞核、线粒体等可溶性样品：血清、尿液等细胞裂解的方法1、温和裂解的方法:裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。细胞破碎方法应用对象操作步骤渗透溶胞法非常温和的裂解方法，可用于进一步进行亚细胞分级。血细胞、组织培养细胞将细胞悬浮于渗透溶胞溶液中，细胞溶胀而释放出细胞内容物冻融裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解。细菌细胞、组织培

6、养细胞使用液氮，快速反复冻融至符合实验要求为止。裂解液裂解含去污剂的裂解液处理组织、细胞以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。组织培养细胞将细胞直接置裂解液或样品液中，进行悬浮处理。酶裂解有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温和裂解植物细胞、细菌细胞、真菌细胞将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。2、剧烈的细胞裂解方法:破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞破碎方法应用对象操作步骤超声波处理超声波产生剪切力使细胞破碎悬浮细胞要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行

7、压力杯法（FrenchPress）用高压使细胞穿过小孔，产生剪切力从而撕破细胞微生物细胞，如细菌、霉菌、酵母细胞及含有细胞壁的细胞将细胞悬浮液置于预冷的压力杯中，施加压力，然后收集挤出液研磨法固体组织细胞、微生物细胞组织或细胞预先用液氮冷冻，然后置瓷研钵中研磨成粉末。加氧化铝或砂有助于研磨机械匀浆法（防止细胞破碎释放出蛋白酶，引起蛋白质修饰）固体组织，如心脏、肝脏、肾脏组织和细菌悬液先尽量将组织剪成小块，然后加有蛋白酶抑制剂的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集。蛋白质的分离与提取方法硫酸铵沉淀高盐溶液中

8、，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶搅拌情况下，缓慢滴加(NH4)2SO4到饱和，离心分离蛋白三氯乙酸沉淀10-20％即可沉淀蛋白；再溶解困难丙酮沉淀常用方法加入3倍以上体积丙酮，-20C沉淀2h以上，离心分离蛋白三氯乙酸－丙酮沉淀同时加入三氯乙酸和丙酮，-20C沉淀，离心分离蛋白；再溶解困难苯酚提取－甲醇中乙酸铵沉淀饱和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用NH4Ac和丙酮洗涤沉淀裂解液的组成目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚