二维电泳详细过程.doc

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1、北京六一仪器厂DYCZ-26C双向电泳系统检测报告技术部吴承疆QQ:实验原理：双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr,相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量等信息。实验方法：一.实验材料:1

2、.主要仪器和试剂（sigma,Ampholine购自GE）主要试剂超纯水（MiLiQ）、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、CHAPS（3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐）、Ampholine（PH3-10或4-75-8）碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid）、十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylsulphate，SDS）、溴酚蓝(BromophenolBlue)、低熔点琼脂糖、过硫酸铵(AmmoniumPe

3、rsulfateAPS)、TEMED（四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；Tris碱、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸、甘油（丙三醇glycerin）、牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA）、蛋白质marker、蛋白定量试剂盒主要仪器DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、0.1毫克级电子分析天平、超声波细胞破碎仪、Millipore纯水仪(法国)、Eppendorf普通离心机、beckman高速冷冻离心机、瞬时离心机、恒温磁力搅拌器、UMAX扫描仪(台湾)；恒

4、温摇床、pH计、恒温振荡器等。本次试验材料：动物组织二.实验试剂的配制样品裂解液尿素8M4.805gCHAPS4%0.4gDTT65mM0.098g（现加）每小管5毫克2%Ampholine（40%）0.5ml（现加）每小管25微升溴酚蓝0.001%10μl（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml，分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存样品覆盖液（含8mol/L尿素，1%Ampholine）取4.8g新鲜尿素（超纯），0.3mlAmpholine，用去离子水定容至10mL，分装，每管含有100uL，置于-20℃冰箱内保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTr

5、is-HCl0.375MpH8.825ml（1.5MpH8.8Tris-HCl）甘油20%20mlMilliQ水定容至100ml分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml（10%SDS）溴酚蓝0.001%100μl（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至100ml加热溶解至澄清，室温保存。第一向聚丙烯酰胺凝胶储液丙

6、烯酰胺7.09g甲叉双丙烯酰胺0.405gMilliQ水溶解后定容至25ml第二向30%聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水溶解后定容至500ml滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。1.5mol/LTris碱pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。10%SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10%ApAp0.1gMilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4℃冰箱保存。10×电泳缓冲液（1×=25mMTris，192mMglycine，0.1%

7、SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。第一向电极液母液（用前稀释10倍）正极电极液母液（0.1mol/L磷酸）：取6.75mL磷酸用去离子水定容至1000mL。负极电极液母液（0.2mol/LNaOH）：取16.48gNaOH，用去离子水定容至2000mL，置于4℃冰箱内可以保存2周。注意：正负极缓冲液体系有多种，要分离不同PH范围的蛋白质，需要选择恰当的缓冲液体系。3.实验操作A.第