丹参酮ⅡA对AS病灶中内质网应激相关基因表达的研究-论文.pdf

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1、LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2014VOL．25NO．6时珍国医国药2014年第25卷第6期丹参酮ⅡA对AS病灶中内质网应激相关基因表达的研究赵君玫，王建新，沈晓君，张娜，陈芳(1．河南中医学院，河南郑州450046；2．河南省医药学校，河南开封475001；3．河南省人民医院，河南郑州450008)摘要：目的探讨丹参酮ⅡA在HCY诱导兔动脉粥样硬化病灶内质网应激相关基因表达的作用。方法复制兔As模型，对照组饲喂普通饲料，高脂组在普通饲料中加入1％胆固醇及0．02％蛋氨酸。饲喂9周后，快速截取胸主动脉上段，组

2、织原位杂交检测兔动脉粥样硬化(AS)病灶中内质网应激相关基因BIP的表达。结果组织原位杂交发现VSMCBIP基因在AS病变部位高表达，BIP基因参与AS病变。结论丹参酮ⅡA促进VSMC凋亡作用机制之一是放大内质网应激信号，BIP基因是其作用靶点之一。关键词：丹参酮ⅡA；同型半胱氨酸；动脉粥样硬化；内质网应激；基因表达DOI标识：doi：10．3969／i．issn．1008-0805．2014．06．029中图分类号：R285．5文献标识码：A文章编号：1008-0805(2014)06—1357-02内质网是重要的细胞器之一，由膜围成管状或扁平囊状的结1．2动

3、物日本大耳白兔，雄性，体质量1．8—2，0kg，普通级，由构，互相连通成网，构成细胞质中的扁平囊状系统⋯。内质网蛋河南康达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(豫)2005—白折叠负荷及处理该负荷能力之间的不平衡导致了内质网应激0002。(endoplasmicreticulumstress，ERS)。持续的ERS最终可导致细1．3仪器LeicaDMR病理成像系统，德国Leica公司产品；BH胞死亡。过长时间暴露于ERS，细胞cyclinD1翻译减少可使细—NIC—B型显微镜，日本OlympsuOptical公司产品。胞周期停止在G，期J。这个反应可能使细胞

4、停止在细胞某一2方法周期以待决定适应性变化是否可行，或者是否起始凋亡过程。2．1模型分组及制备选取日本大耳白兔，雄性，体质量1．8—BIP被认为是ERS的一种标志蛋白，在应激反应调节时其基因2．2kg，适应性喂养1周。依据体质量随机分为空白对照组和高的转录活性可显著提高，BIP的表达是细胞的一种适应性保护反脂组，每组6只。对照组饲喂普通饲料，高脂组在普通饲料中加应，但是随着应激反应的演进，过度的ERS可激活下游的凋亡信入1％胆固醇及0．02％蛋氨酸，连续饲喂9周。号分子，促使细胞发生凋亡，由此可见，ERS是存活程序和凋亡程2．2探针制备提取兔VSMC细胞总RNA

5、，设计BIP部分序列扩序同时被激活的过程一。增引物，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，以B—actin为内参多项研究证实，丹参酮ⅡA具有抗心律失常、抗心肌肥厚和照，扩增BIP基因片段。PCR产物用1．5％琼脂糖凝胶电泳分缺血，改善内皮功能等多种心脑血管系统药效作用，此外丹参酮离，切下目的片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。目的片段与质ⅡA还具有良好的调节血脂、降低血HCY水平抗As作用。本实粒pMD19一T载体重组连接，采用质粒提取纯化试剂盒进行质验通过原位核酸探针杂交的方法研究BIP基因在As模型中血粒DNA小量制备及纯化，直接扩增目的基因片段；制备感受态细管

6、平滑肌细胞(VSMC)的表达情况，以及丹参酮ⅡA对其的调控菌，连接产物转化大肠杆菌，用限制性内切酶BamHI单酶切，作用及可能的作用靶点，探讨丹参酮ⅡA对HCY诱导动脉粥样BamHI和HincII双酶切重组质粒pMD一19T—GRP鉴定，地高硬化病灶中VSMC凋亡抗As疗效的分子机制，为丹参酮ⅡA临辛标记。床应用提供实验依据。2．3形态学观察实验结束处死动物，截取胸主动脉上段置4％1材料与仪器多聚甲醛中，按照常规步骤进行脱水、浸蜡、包埋、切片，采用伊红1．1药物与试剂丹参酮ⅡA对照品购自中国药品生物制品鉴一苏木素(HE)染色的方法对组织进行观察，记录结果。定所，

7、批号：200619；HCY，Sigma公司产品，批号：C一7352；兔2．4原位杂交按照常规步骤进行脱水、浸蜡、包埋，切片(玻片VSMC由中国协和医科大学基础医学院细胞培养中心提供；Insi—采用多聚赖氨酸预处理)，切片厚度6～8m。参考文献进行tuApoptosisDetectionKit。pMD一19T载体，DNA连接酶，大肠杆原位杂交：①灭活内源性酶滴加30％H：0：1份+蒸馏水10份混菌JM109，限制性内切酶BamHI，限制性内切酶HincⅡ，Taq酶合，室温处理10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗涤3次。②暴露均为大连宝生物工程有限公司产品；抗地高辛标

8、记HRP检测试mRNA核