2005年植物生理学实验总结.doc

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1、实验1叶绿体色素的提取、分离教学目标与基本要求：1．了解叶绿体色素的提取方法；2.学习叶绿体色素的纸层析分离方法。实验内容或指导思想：1．以有机溶剂提取；2.准备滤纸条并点样；3.将滤纸条固定在有展层剂的试管中；4.观察分离结果。    一、原理    叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当

2、的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。    二、材料、仪器设备及试剂    （一）材料：菠菜、小白菜叶片    （二）仪器设备：1.研钵；2.漏斗；3.三角瓶；4.剪刀；5.滴管；6.培养皿（直径11cm）；7.康维皿或平底短玻管；8.圆形滤纸（直径11cm）；    （三）试剂：1.95％乙醇；2.石英砂；3.碳酸钙粉；4.推动剂：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配制（V／V）。    三、实验步骤    1.叶绿体色

3、素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。（2）研钵中加2～3ml95％乙醇，研磨至糊状，再加10～15ml95％乙醇，提取35min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml95％乙醇冲洗，一同滤于三角瓶中。（3）如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉2g放入小烧杯中，加95％乙醇20～30ml浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。    2.叶绿体色素

4、的分离：（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好

5、培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。叶绿素含量的测定    一、原理    根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光

6、光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需

7、测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。    二、材料、仪器设备及试剂    （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。    （二）仪器设备：1.分光光度计；2.电子顶载天平（感量0.01g）；3.研钵；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量滤纸；7.吸水纸；8.擦境纸；9.滴管。    （三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。    三、实验

8、步骤    1.取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2.称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3.取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml