植物生理学实验

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1、.本科学生综合性实验报告光合色素的提取、理化性质分离、吸收光谱及含量的测定学号：134120171姓名：王晓莲学院：生命科学学院专业、班级13生物科学C班实验课程名称：植物生理学实验教师及职称：李忠光开课学期：2015至2016学年下学期填报时间：2016年4月2日云南师范大学教务处编印..实验序号实验二实验名称光合色素的提取、理化性质分离、吸收光谱及含量的测定实验时间2016.3.15-29实验室睿智三4281．实验目的（1）掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。（2）掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。（3）掌握用分光光度计测定叶

2、绿素含量的方法2．实验原理Ⅰ光合色素的提取与理化性质光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。..Ⅱ光合色素的分离与吸收光谱光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。叶绿素

3、的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。Ⅲ光合色素含量的测定混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A=kLC）求出各组分含量。Lambert定律：A=kL；Beer定律A=kC。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程Ca=12.7A663–2.69A645；Cb=22.9A645–4.68A663Ca+b=8.02A663+20.20A645A663=Ca.ka1+Cb.kb1A645=Cb.kb2+Ca.ka2由于K是一个常数，

4、而A可以通过分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为：ε——..摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为：2．实验设备及材料（1）材料新鲜植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、20%KOH甲醇溶液、苯、自来水、50%醋酸、醋酸铜、启动剂、80%丙酮（2）实验设备试管、滤纸、研钵、玻璃棒

5、、锥形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、烧杯、漏斗、离心机、便携式叶绿素测定仪、分光光度计、天平、离心管、滴管4．实验步骤Ⅰ光合色素的提取与理化性质（1）光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。（2）观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。（3）光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。（4）皂化反应：..取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml

6、，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。（5）取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。II光合色素的分离与吸收光谱（1）光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。（2）光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→用上行纸层析法分离色素→启动

7、剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1（3）吸收光谱的测定光合色素的吸收光谱：取色素溶液1mL，加入丙酮3mL，摇匀后在分光光度计上400到700nm处每隔10nm进行扫描。各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3mL丙酮中，按上述方法扫描。III光合色素含量的测定方法一：快速测定法由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k=34.5Lg-1...cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2方法二:分光光度计法色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加

8、入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml8