生物技术制药试验.doc

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1、生物技术制药实验武汉大学药学院生物技术实验室23湖北·武汉23目录实验一质粒DNA的小量制备2实验二质粒DNA电泳鉴定4实验三感受态细胞的制备和转化5实验四目的基因的表达及表达产物的初步提取8实验五蛋白质纯化—盐析沉淀法10实验六凝胶过滤层析14实验七蛋白质免疫印迹实验（WesternBlotting）16实验八HRP结合物的过碘酸钠交联法1923实验一质粒DNA的小量制备【目的】学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。【原理】根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的

2、条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。【器材】超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。【试剂】pET-28a质粒载体菌,LB培养基1000ml（含10mg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液（溶液II），KAc溶液（pH4

3、.8）（溶液III），RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。【实验准备】1.配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20°C保存）。2.配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mL双蒸水搅拌完全溶解，用约200mL5NNaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121°C灭菌20min）。3.溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）。溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。溶液II（0.2mol/LNaOH

4、，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补双蒸水至100ml）。4.70%乙醇（-20°C保存）。235.TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.0）。6.试管洗净并塞上棉塞，1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，高压灭菌（121°C，30min）。【操作步骤】1.在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的试管中。2.取出保存的携带pET-28a质粒的菌种,在超净工作台上用接种环移取少量菌种至5ml无菌的LB培养液（含10ug/ml卡那霉素）中，37°C摇床中振荡培养

5、20h。3.取1ml的菌液至1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。4.在沉淀中加入预冷的100ml溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。5.加入200ml溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。切勿剧烈振荡。冰浴中放置5min。6.加入预冷的150ml溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，冰浴放置5min。7.12000rpm离心5min，小心吸取400ml上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800ml9

6、5%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。8.12000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500ml70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000rpm离心10min，小心弃掉上清液，倒置尽量流尽。9.再加入500ml70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。10.离心管倒置于37°C温箱中（或室温）空气干燥10分钟。11.加入10mLTE缓冲液，涡旋混合器上轻微振荡混匀，离心机中瞬时离心将溶液收集于管底。用记号笔标记后放入冰箱中冷藏待

7、电泳确认。12.在剩余的菌液中倒入少许新洁尔灭，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器。13.撰写实验报告。【思考】影响本实验结果的主要因素有哪些？23实验二琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA【目的】学会常用的琼脂糖凝胶电泳法分离和鉴定DNA。【原理】DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。【器材】电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，25