特应性皮炎患者外周血单个核细胞Toll样受体2、4表达研究-论文.pdf

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1、412临床皮肤科杂志2014年43卷第7期JClinDermat~July20，Vo1．No．论著特应性皮炎患者外周血单个核细胞Toll样受体2、4表达研究常晶，张悦，张丽，韩秀萍(中国医科大学附属盛京医院皮肤科，辽宁沈阳110004)【关键词】皮炎，特应性；Toll样受体；实时荧光定量PCR[中图分类号】R758．23[文献标识码]B[文章编号】1000—4963(2014)07—0412—03特应性皮炎(AO)又名异位性湿疹、体质性痒疹、1．2方法或遗传过敏性湿疹。是一种慢性复发性、瘙痒性，炎症1．2．1分离

2、外周血单个核细胞无菌抽取外周静脉性皮肤病，病因及发病机制复杂，至今仍未完全明确。血1mL予以3．8％枸橼酸钠抗凝备用；在10mL离心皮肤屏障异常及多种致病微生物如金黄色葡萄球菌、管中加入2mL人淋巴细胞分离液；取新鲜的乙二胺真菌及易感病毒的寄居。可以诱发或加重AD[，但机四乙酸(EDTA)抗凝血1mL加人等体积PBS颠倒混制尚不清楚。匀后．用注射器吸取，缓慢加至淋巴细胞分离液液面本研究采用实时定量PCR技术测定并比较AD上方：1500r／min。20℃离心15min，小心吸取第2层患者组和正常对照组外周血单个核细

3、胞(PBMCs)Toll云雾状细胞，放入新的离心管中，加人PBS至5mL；样受体(TLR)2、4的表达。以探讨天然免疫炎症反应1500dmin，20cC离心10min．弃去上清．加入PBS至在AD发病中的作用。5mL，吹吸打散下方细胞沉淀；1500r／rain，20℃离心10min，弃去上清，加入RPMI1640培养液1mL，吹吸1资料与方法打散下方细胞沉淀：移入EP管中，一80℃冰箱中保存。1．1资料1．2．2总RNA提取取出样本，缓慢复温融化后，以1．1．1标本选择选择2011年7月一2011年12月8000

4、r／min．4oC离心2min，弃去上清。加入1mL经本院皮肤性病科门诊临床确诊的27例重度急性或Trizol。用微量移液器反复吹吸直至看不到明显细胞沉亚急性AD患)L(AD组)，其中男22例，女5例，年龄淀，室温静置5min；加入0．2mL氯仿，用力震荡15S，2个月～10岁，中位年龄5个月。诊断均符合Williams室温静置5min；12000r／rain，4℃离心15min，小心吸等f3】及Rajka等的AD诊断标准。病情严重程度根据取上清液，移入新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒欧洲AD评分标准(SCOR

5、AD)来评分，客观指标=A／B混匀后室温静置10min：12000r／min，4℃离心10(A=皮损面积评分，B=皮损严重程度评分)，客观体征min，弃上清，缓慢加入75％乙醇1mL及水20溶评分确定疾病严重程度：<15分为轻度．15—40分为中解RNA；紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度；一80℃度，>40分为重度。至少1周内未外用过糖皮质激素，冰箱中保存。4周内未系统接受过糖皮质激素、免疫抑制剂及光疗。1．2I3反转录合成eDNA取1支新的0．2mLEP管。对照组29例为我院小儿外科无过敏性皮肤疾病及感在冰上

6、依次加人以下溶液：5xPrimeScript~Buffer(for染性疾病的患儿(正常对照组)，年龄1～10岁，中位年RealTime)，2~L；PrimeSeript@RTEnzymeMix10．5龄4岁。txL；OligodTPrimer(50txmol／L)，0．5txL；Random61．1．2主要试剂人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物mers(100b~mol／L)，0．5~L；TotalRNA；RNaseFree制品科技有限责任公司)；Trizol(TaKaRa公司)；DNAdH20，Upto10IxL。

7、反应条件：37℃，15min，85oC，5S。合成试剂盒及realtime—PCR试剂盒(TaKaRa公司)：1．2．4PCR扩增Medline基因库检索各基因全序引物(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)；磷酸盐缓列，以Primer5．0设计引物，GAPDH为内参照。(TLR一冲液(PBS)：2．25gNaC1加0．1g，NaH2PO4·2H2O加2：5’一TGATGCTGCCAITI1CTCATTC一3’，5’一CGCAGCTC1．5g，NaHPO·12H：O，蒸馏水定容至250mL，高压灭TCAGATITrAC

8、CC一3’；TLR一4：5’一AATCCCCTGAGGCA菌。其他：氯仿、异丙醇、无水乙醇、焦碳酸二乙酯TITAGG-3’，5’一AAACTCTGGATGGGG1TrCC一3’；(DEPC)水等GAPDH：5’—CCTCTGACTTCAACAGCGACAC．3’．5’—TCCACCACCCTGTI?GCTGTA一3’)配置PCR反应液，在冰上进行『SYBR~PremixE