肽配基纳米亲和载体定向固定化抗体-论文.pdf

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1、离子交换与吸附，2014，30(3)：193～202IONEXCHANGEANDADS0RPTION文章编号：1001—5493(2014)03．0193．10肽配基纳米亲和载体定向固定化抗体朱俐燕白姝孙彦余林玲¨系统生物工程教育部重点实验室，天津大学化工学院，天津300072摘要：抗体经常被固定在某一固相载体表面用于免疫检测分析，但通常得到的是随机固定化的抗体，因而会影响抗体的活性。本文开发了一种新型的亲和载体用于抗体的定向固定化。即将与抗体IgG的Fe片段具有亲和作用的肽配基偶联于pGMA纳

2、米球上，制备亲和载体用于吸附抗体实现抗体的定向固定化。首先利用乳液聚合法制备了粒径为110rim的pGMA纳米球，再以EDMA为交联剂并且在纳米球表面氨基化，最后将与抗体IgG的Fc片段具有亲和作用的肽配基HWRGWV偶联于纳米球表面，制备得到肽配基纳米球亲和载体。然后，考察了亲和载体对猪IgG的吸附行为。进一步，利用等温滴定微量量热仪研究了该纳米球亲和载体与IgG之问的相互作用热力学。结果表明，肽配基亲和载体对IgG的特异性吸附作用明显高于肽配基修饰前的载体．亲和载体与IgG的亲和作用主要贡献

3、是疏水相互作用；而G与氨化纳米球载体的吸附作用则主要通过静电作用和氢键作用。所制得的纳米球亲和载体可用于进一步开发高效率、高灵敏度的临床免疫检测方法。关键词：抗体；定向固定化：肽配基；纳米载体；亲和中国分类号：TQ033文献标识码：A1前言抗体具有非常高的专一性，能够特定识别相应的抗原物质。抗体常常被固定在某一固相表面，用于抗原的分离纯化、固相免疫分析用于疾病诊断以及免疫芯片等【1】。固定的抗体需要保持其生物活性和功能性。抗体分子的活性部位在两个Fab片段上，Fc片段是相对保守的一个区域。抗体分

4、子表面的疏水基团和带电基团使其可以通过物理吸附作用结合到固相表面，这类方法的缺点在于抗体的非定向固定造成活性的丢失，且容易脱落【6】。另外，可将抗体共价偶联到固相表面，这主要是基于蛋白表面与固相表面的功能基团化学反应，这类方法最大的优点就是结合的稳定性，缺点仍然主要在于抗体的非定向固定造成活性的损失。为了解决抗体被固定化后活性比率降低的问题，目前已经成功研究出几种定向固定化抗体的方法。蛋白A和蛋白G可与抗体的Fc片段发生特异性结合【7{】，1978年Gersten和Marchalonis【9】首

5、先将抗体偶联到固定有蛋白A的琼脂糖凝胶上以提高抗原的结合容量。·收稿日期：2014年5月21日项目基金：科技部863项目(No．2012AA020206)．作者简介：朱俐燕(1988年一)，女，~q)l省人，硕士．¨通讯联系人：E-mail：yulinling@tju．edu．cn·194·IonExchangeandAdsorption2014年6月抗体也能通过IgG分子Fc片段的糖链氧化来达到定向固定化的目的，O’Sharmessy和Quarles【1UJ最先用实验证明了该结论。近几年的研究

6、发现，ZZ序列是一段能与IgG的Fc一片段相互作用的串联序列，由金黄色葡萄球菌体内分离的蛋白A得到。Masumi【n】等人开发了一种能用于药物或基因载体的纳米颗粒，表面为肝炎病毒B表面抗原(HBsAg)的L蛋白，通过将其S1-$21序列替换为上述的ZZ序列制得了能有效地结合IgG的纳米颗粒ZZ-BNC，通过结合IgG的Fc片段能暴露几乎所有的F(ab’)2片段用于抗原的有效结合。他们将其应用于酶联免疫分析，另外还将其与亲和素．生物素系统和蛋白印迹分析方法联用，灵敏性大大提高。Lu¨zJ等人也曾发

7、现，抗体分子Fab’片段上的巯基同样可以用于定向固定反应，比随机固定的抗体活性提高了3倍。Yang等人【ll6】筛选得到了可以结合人IgGFe片段的线性六肽HWRGWV，研究表明该配基与IgG的结合常数能达到lOl0～，且对IgG有很好的选择性，最重要的是该配基能有效地结合IgG的Fc片段，并进～步用实验和计算机模拟的方法对这一结论进行了验证【1】。本文尝试用乳液聚合法制备甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米球，将上述的六肽配基HWRGWV固定于纳米球上制各亲和载体，用于定向吸附抗体分子(Fe片段)。纳米球

8、亲和载体的制各与修饰反应过程如图1所示。考察亲和载体与IgG的静态吸附行为，并使用等温滴定微量量热仪(ITC)进一步分析研究纳米球与IgG之间的相互作用热力学。：rH~IH~H—，．／＼。lO◇⋯v}oI：·‘j～、。／＼HO}

9、Fig．1PreparationandSurfaceModificationofpGMANanoparticles2实验部分2．1仪器和试剂HZS．H型恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发公司)：ZetasizerNanoZS型纳米电势粒度分析仪(英国Malvem公司