可溶性啮齿目动物CD59功能多肽的制备及生物活性鉴定-论文.pdf

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1、安徽农学通报，AnhuiAgri．Sci．Bul1．2014，20(13)可溶性啮齿目动物CD59功能多肽的制备及生物活性鉴定尤涛董洲张可可(1安徽医科大学药学院，安徽合肥230032；2安徽医科大学第一附属医院，安徽合肥230022；3武汉大学人民医院，湖北武汉摘要：构建含啮齿目动物小鼠的CD59a功能片段及6xHis键的质粒载体，将其转染入原核生物表达体系BL21大肠杆菌，扩增，裂解细菌，层析柱纯化，得到CD59a功能多肽，并运用SDS—PAGE鉴定其分子量，经典及替代途径溶血实验鉴定其生物活性。结果表明：利用基因工程的方法在原核BL

2、21大肠杆菌表达体系中可制备有良好的抑制补体溶血活性的小鼠CD59a功能多肽，其分子量约18．4KDa，为啮齿目动物CD59的功能研究以及进一步的动物实验奠定了基础。关键词：CD59；原核生物表达体系；生物工程中图分类号Q78文献标识码A文章编号1007—7731(2014)13—23—03CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于细胞膜公司；Eppendorf58IOR台式高速冷冻离心机，德国Eppen。表面的补体抑制蛋白，广泛分布于动物多种组织细胞表dof公司；紫外分光光度计UVC一515型，美国ULTRA—面，并能以游离形式存在

3、于尿液、唾液、泪液等多种体液LUM公司；恒温细菌培养摇床，美国lab—lineinstruments中。CD59在补体系统激活后的酶级联反应的终末，阻碍公司；垂直电泳仪，美国Bio—Rad公司；Vortex—Genie2多c8与c9分子的结合，抑制补体终末反应物MAC(C5b—功能旋涡混合器，美国ScientificIndustries；U—Tube蛋白C9n复合物)的形成，从而保护细胞免受MAC导致的细胞收集器，美国novagen公司。裂解效应。故CD59与动物的免疫系统密切相关，可抵御病原微生物激活补体对动物组织细胞的杀伤作用，是动物

4、自体免疫调节的重要膜蛋白。获得具有良好生物活性的CD59功能多肽，有助于对CD59功能的进一步研究。笔者尝试应用组织工程技术，利用原核的大肠杆菌BL21表达体系制备重组啮齿目动物小鼠的CD59a功能部位多肽，并应用溶血实验鉴定其生物学活性，为啮齿目动物CD59的功能研究以及进行进一步的动物实验奠定了基础。1材料与方法1．1材料1．1．1研究对象BL21大肠杆菌，由中国科技大学大分子结构与功能实验室提供；Pat28a质粒(其图谱见图1)：his键连接位点为Ndel，购自美国novagen公司。1．1．2主要试剂IPTG(isopropylb

5、eta—D—thiogalacto．图1Pat28a质粒图谱side，Ipreparedat1M)，美国invitrogen公司；BugBuster1．2方法MasterMix细胞裂解液，美国novagen公司；cocktail蛋白1．2．1小鼠CD59功能多肽质粒栽体的构建根据gene—酶，美国novagen公司；SDS—PAGEmarker，美国TEDIA公bank及Uniport得到小鼠CD59a功能部的基因序列。司；His—Bind纯化Kit，美国Novagen公司。CD59a功能部一6his序列：共228bpGAArrccTcA

6、cAT1．1-3主要仪器一80℃深低温冰箱，美国FarmaSeientif-GCTACCACTGTICCAACCGGTGG兀TCTTCATGCAATAic公司，Eppendof5414台式高速离心机，德国EppendofTGAACAGCACTTGCTCTCCTGACCAGGATrCCTGTCTCT基金项目：国家自然基金面上项目《重组CD59蛋白治疗创伤性脊髓损伤及其免疫学机制的研究》，批号81171797；湖北省自然科学基金面上项目(MBP抗体在脊髓损伤中的作用及免疫治疗的研究》，批号2011CHB022。作者简介：尤涛(1974一)，男

7、，安徽庐江人，博士，副主任医师，校聘副教授，研究方向：蛋白质药物的研发及临床应用。通讯作者收稿日期：2014—06—2224安徽农学通报，AnhuiAgri．Sci．Bul1．2014，20(13)Al’GCl’I’AGCCGGAAI’GCAAGl’G

8、l’Al’CAAAGG’l’GI”I’GG次。加入GVB++9001~L后分管。羊抗小鼠RBCIgG抗体AAACAATCAGAITGTCATGGTGAGATCAITATGGACCA2。GVB++稀释到50。不同剂量的CD59功能多肽，ATI’AGAAGAGACAAAATrAAAATTCAG

9、ATGCTGC．加入501xL的正常小鼠血浆96孔板的每个孔中加入CAGTrI1AACTTGTGTAACTAGCTCGAG。1001xL的红细胞悬液，然后加入不同稀释浓度的CD59功引物设计为