产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立-论文.pdf

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1、第36卷第8期中国预防兽医学报Vo1．36．No．82014年8月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineAug．2014doi：10．3969~．issn．1008—0589．2014．08．17产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立杨绪秋，方一臻，张艳艳，范红结(南京农业大学动物医学院，江苏南京210000)摘要：为建立检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4菌毛抗体的方法，本研究以纯化的重组F4菌毛蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法，并对该方法的反应条件进

2、行了优化。确定ELISA最佳条件为：包被抗原浓度为3．5ng／孔；5％脱脂奶封闭液封闭2h；血清最佳稀释度为1：3200、血清最佳作用时间为1h；酶标二抗的最佳作用时间为1h。该方法对F5、F6菌毛阳性血清和猪链球菌阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性。其组内和组间的变异系数均小于l0％，具有良好的重复性。利用建立的间接ELISA方法检测血清并采用PCR方法检测其肛拭子进行符合性试验，其总符合率为96．2％。临床检测3l2份未经ETEC免疫的猪血清，阳性率为9．9％。表明该方法可以用于ETECF4茵毛抗体的临床检测。关键词：产肠

3、毒素大肠杆菌；F4茵毛；间接酶联免疫吸附试验中图分类号：$852．61文献标识码：A文章编号：1008．0589(2014)08．0655．04DevelopmentofanindirectELISAfordetectingspecificantibodytOF4pilusproteinofenterotoxigenicEscherichiacoliYANGXu—qiu，FANGYi—zhen，ZHANGYan—yan，FANHong~ie(CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgricultu

4、reUniversity，Nanjing210000，China)Abstract：ToestablishanassayfordetectionoftheantibodyagainstenterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)，anindirectELISAwasdevelopedwiththepurifiedrecombinantF4pilusproteinasthecoatingantigenexpressedfromE．coli．Thereactionconditionswereoptimiz

5、edascoatingwith3．5ngofrecombinantF4proteinperwel1．blockingwiththe5％skimmedmilkfor2hours．anddetectingwithHRP—labeledSPAin1：5000dilution．Itwasprovedthatthemethodwasspecificandrepeatablebycrossexperiment，blockingtestandrepeatedexperiment．Thecoincidenceratebetweentheindi

6、rectELISAforserumsamplesandPCRfortherectalswabsampleswas96．2％．Atotalof312swineserumsamplescollectedfromnon—ETECimmunizedpigsweredetectedbytheestablishedindirectELISA．thepositiveratewas9．9％．KeyWOrds：enterotoxigenicEscherichiacolirETEC)；F4pilus；indirectELISA产肠毒素大肠杆菌fEn

7、terotoxigenicEscherichia素，引起剧烈腹泻，给养猪业造成严重的经济损失【j-21。coli，ETEC)是引起新生仔猪大肠埃希氏菌性腹泻的目前，在猪源ETEC中发现的菌毛抗原有F4、F5、病原。ETEC以其菌毛与新生仔猪小肠上皮细胞的F6、F17、F18、F41、F42、F165等，而引起新生仔受体结合，在肠道内定植并大量增殖，产生肠毒猪腹泻的菌毛主要以F4为主[3．5]。*Correspondingauthor收稿日期：2014．01．09基金项目：江苏省科技支撑计~tJ(BE2013433)作者简介：杨绪

8、秋(1989．)，男，江苏南京人，硕士研究生，主要从事病原微生物和免疫学研究通信作者：E-mail：mj@njau．edu．ca656中国预防兽医学报2014正目前，对ETEC致病因子菌毛的血清学检测方滴定试验，37。C温育1h；SPA．HRP(1：5000)，