^137Csγ-射线诱导小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型的建立-论文.pdf

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1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2014，30(187文章编号：1007—8738(2014)01—0087—037Cs射线诱导小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型的建立路璐，黄颂，李德冠，张俊伶，琊永华，李程程，孟爱民(中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所，天津300192)[关键词]射线；小鼠胚胎成纤维细胞；衰老[中图分类号]R392—33[文献标志码]B随着老龄人口的增加，各种老年疾病随之而来，液清亮为止；将6—8个胚胎转移至一个小的无菌平皿中，用如何延缓衰老已经成为世界各国学者研究的热点。眼科剪将胎鼠躯干剪成1mm以下的碎块；将

2、剪切好的组织小块送人培养瓶内，在瓶壁上均匀摆置；组织块放置好后，研究衰老机制，建立衰老模型尤为必要。有学者根轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量培养液，据衰老的自由基理论，利用一定剂量的射线照射建盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37~(2孵箱内。放置2—4h待立衰老模型J，但检测的衰老相关指标较少。为此组织小块黏附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。原代采用”cs^y射线照射小鼠胚胎成纤维细胞(mouse培养3～5d，需换液1次，去除漂浮的组织和残留的血细胞。embryofibroblast，MEF)，探讨衰老模型的建立。细胞铺满培养瓶底80％～90％时消化

3、传代，继续培养或冻存。传代和冻存同常规细胞培养。1材料和方法1．2．2^y射线诱导小鼠胚胎成纤维细胞衰老将生长状态良1．1材料本研究所用材料信息如下：H．DMEM培养液好的第3代MEF细胞分别接种于6孔板和24孔板中，(Gibco公司)；优级胎牛血清(杭州四季青公司)；青霉素H—DMEM培养液，37℃、50mL／LCO培养，待细胞生长融合5000U／mL、链霉素5000mr,／mL、L一谷氨酰胺2mmol／L，冻至80％左右，用10．0GyCs'y射线照射细胞。同时设立对存液：细胞培养液添加100mL／LDMSO(北京鼎国公司)；消照组，对照组接受假照射。化液：

4、含2．5g／L胰蛋白酶和0．2g／LEDTA(Gibco公司)；1．2．3实时荧光定量PCR检测p16基因mRNA表达水平的Real—timePCR试剂盒(ABI公司)；衰老相关B一半乳糖苷酶变化细胞照射后24h，收集细胞，用TRIzol法提取细胞的(senescenceassociated—B—galactosidase，SA—B—ga1)染色试剂盒总RNA。取少量用于RNA含量及纯度测定。总RNA按照TurboScript逆转录第1链cDNA合成试剂盒进行cDNA第(CellSignaling公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，RIPA裂解液1

5、链的合成。cDNA反转录反应体系20，反应条件为65~C(Pierce公司)，BCA试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，兔5min，42℃50min，70~(215min；用实时荧光定量探针法检测抗小鼠pl6、兔抗小鼠B-actin一抗和山羊抗兔二抗(Santa样品中的成熟mRNA分子的水平，实时荧光定量PCR反应体CruzBiotechnology公司)。其他试剂均为国产或进口分析纯系25，反应条件为50℃2min，95oC10min，(95℃15s，试剂。ABIPrism75O0SequenceDetectionSystem7000实时荧6ooC1s)×40循

6、环。每个样本重复测量3次。以GAPDH的表光定量PCR仪为ABI公司产品；ChemiDocXRS成像系统达量为参照标准，按照2。△△c计算p16mRNA相对表达量。为Bio．Rad公司产品；Autoell40”cs射线照射源，剂量率1．2．4Westernblot法检测p16基因蛋白表达水平的变化0．8OGy／min，为加拿大原子能有限公司产品；NikonEclipse收集照射后24h的细胞，PBS洗涤2遍，细胞总蛋白抽提液90i型荧光显微镜为Nikon公司产品；AccuriC6型流式细胞仪提取总蛋白，并采用BCA法检测样品中蛋白的含量。取总蛋为BD公司产品。C

7、57BL／6小鼠，体质量18—22g，购自北京白20IXg混合蛋白上样缓冲液，在100℃加热10min，采用维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2008-0003，150g／LSDS-PAGE进行电泳分离，电泳后转至PVDF膜。转饲料为清洁级全价鼠料，由北京科奥协力饲料有限公司提供。膜结束后室温封闭1h，加入兔抗小鼠p16抗体4~C过夜，洗雄雌鼠1：3合笼，次日早晨检查有阴栓者记为0．5d，选择膜后加人相对应的二抗室温孵育1h，洗膜，最后加ECL显色12～13d孕期雌鼠获取胎鼠。试剂，在ChemiDocXRS系统中成像。另外，采用抗13-actin1．

8、2方法抗体检测B-act