青蛤碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性实验.pdf

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1、42蔼物与人2014年5月第5期第27卷总第317期Medicine&peopleMay2014Volume27NO．5青蛤碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性实验王水霞王珊珊(浙江新昌县中医院浙江新昌3125OO)摘要：目的：探讨青蛤内脏碱性蛋白酶水解物的体外抗氧化活性。方法：利用正交实验确定青蛤内脏碱性蛋白酶的最佳酶解条件，测定水解物对清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合力和还原铁的能力。结果：水解物抗氧化活性最大的影响因素为pH值，最小的影响因素为水解时间，且当温度为5O℃、时间为4h、加酶量为2000u／g、pH为9

2、时，水解物的抗氧化活性最强。在最佳抗氧化水解条件下得到的水解物，对羟自由基、DPPH自由基、Fe离子的螯合作用均有一定的清除活性。结论：碱性蛋白酶对青蛤水解得到的水解物具有较好的抗氧化活性。关键词：青蛤；抗氧化性；清除率【中图分类号]R453【文献标识码lg【文章编号11OO2—3763(201~4)05—0042—021前言物冷冻干燥，检测样品浓度为ling／mL、2mg／mL、3mg／mL、4mg／mL、5青蛤(Cyclinasinensis(Gmelin))分布于我国沿海潮间带的泥砂滩中，mg／mL时碱性蛋白酶水解

3、物对DPPH自由基的清除率。结果见图1所肉质鲜美、营养丰富，经济价值颇高，倍受消费者的青睐价值[。目前，随示，碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大，着海洋生物研究的深入开发和研究技术的提高，从海洋生物中寻找新的天当浓度为5mg／mL时，清除率达到91．24。然抗氧化剂已成为海洋药物研究的重要目标之一[。应用蛋白酶对生物表1碱性蛋白酶水解液对自由基的清除蛋白质进行水解，其水解的溶液中含有大量活性肽和氨基酸，如牛磺酸、胱氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸都具有抗氧化能力。我国已从动植物(如鲢

4、鱼[、牡蛎[]等)中用酶解的方法获取大量活性肽。但有1(4)1(9)48．1关青蛤内脏碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性实验报道不多，本文是以新鲜2(6)2(10)28．6青蛤为原料，利用酶解其肉糜所得的水解液进行清除DPPH自由基、清除3(8)3(1I)24．9超氧自由基、螯合和还原铁的研究。132162材料与仪器2148．32．1实验原料及试剂：新鲜的青蛤，购于舟山市场，去壳后，一20℃冰3228．8箱冷藏备用；碱性蛋白酶194000U／g，工业级，北京亚太恒信生物科技有1236．6限公司；邻二氮菲、DPPH、铁氰化钾购自

5、上海晶纯试剂有限公司，其余试2325．1剂为分析纯均购置国药集团化学试剂有限公司。000033150．82．2仪器：BSA1245型电子天平中国，赛多利斯科学仪器有限公司；33．935．449．1CF16RXⅡ高速冷冻离心机日本，HITAcHZ公司；32．934．O31．3uv～1600PC型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司；37．534．823．9SSW型微电脑电热恒温水槽上海博讯实业有限公司医疗设备厂。。。0504．61．425．23实验方法3．1正交实验：参照文献[，选用碱性蛋白酶，考虑到1(温度)、2(时

6、间)、3(加酶量)、4(pH)四个因素，每个因素选三个水平进行四个因素的正；交实验，比较碱性蛋白酶在不同水解条件下的DPPH自由基清除率，从而斟逝确定碱性蛋白酶的最佳水解条件。璧水解液的制备：青蛤一除去外壳取内脏一内脏破碎一以1：3比例加塞水一加入碱性蛋白酶一水解一沸水灭活一放置冷却一lO000r／min离心}lOmin--~取上清液一冷冻干燥-,-DPPH自由基清除率测定。3．2对DPPH自由基的清除作用：按照文献[6-8]进行∞㈣D∞PP∞㈣H自由。基。0，弧0样晶浓度g／L)清除活性测定。配置DPPH浓度0．1mm

7、ol／L(无水乙醇溶解)避光保存。图1碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基清除率方法：1mL样品+1mLDPPH，混合均匀，避光保存30rain，4000r／min离心4．3水解物对羟自由基清除率；同样设置5个浓度组，即2mg／mL、4lOmin，517rim处测吸光度AiC9]。同时测1mL无水乙醇+lmL样品混合mg／mL、6mg／mL、8mg／mL和10mg／mL，分别检测其对羟自由基的清除的测吸光度Aj，和11TILDPPH+1mL水混合测吸光度Ac。率。结果见图2所示，不同浓度的碱性蛋白酶水解物对羟自由基均有一定D

8、PPH清除率(％)一[1一(Ai—Aj)／Ac]×100程度的清除作用，并且随着浓度升高，清除率增大，对羟自由基的清除率低3．3对羟自由基清除率的测定：参考文献[-1]所述的方法，并做了适于DPPH，当浓度为10mg／mL时，清除率为74．84。当调整。取浓度为0．75mmol／L邻二氮菲lmL在试管中，并且按顺序加