局部miR—126基因治疗促进小鼠缺血后肢血管新生观察.doc

《局部miR—126基因治疗促进小鼠缺血后肢血管新生观察.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、局部miR—126基因治疗促进小鼠缺血后肢血管新生观察［摘要］目的：通过体外构建重组腺病毒miR-126,应用于小鼠缺血后肢腓肠肌局部治疗，观察miR-126对缺血局部具有促血管新生作用。方法：重组腺病毒miR-126包装、纯化、滴度的鉴定；C57小鼠随机分为A组（C57左侧缺血后肢手术组）、B组（空病毒C57左侧缺血后肢手术组）、C组（重组腺病毒miR-126C57左侧缺血后肢手术组）三组，制作小鼠缺血后肢模型，术后即刻将重组腺病毒miR-126和腺病毒各50n1局部注射于小鼠缺血左后肢腓肠肌。

2、分别于3、7、14天各组（3只）取左后肢腓肠肌做HE染色、CD31免疫组化染色、westernblot检测Akt、ERK1/2、pAkt、pERKl/2蛋白水平以及实时定量PCR检测等。结果：各种检测结果显示C组较A、B两组血管内皮细胞增生明显，新生血管数目计数明显增多，miR-126表达水平明显增高，尤其在第7天升高最为明显，以及VEGF、bFGF等介导的IP3和MAPK信号通路中ERK1、pERKl.AKT和pAKT蛋白水平表达明显增高。结论：miR-126局部应用于缺血后肢，通过激活Akt、

3、ERK1/2的相关通路，促进血管新生，利于缺血后肢功能恢复。［关键词］miR-126；缺血后肢；血管新生;Akt；ERK1/2；［中图分类号1R318［文献标识码］A［文章编号11008-6455（2012）10-0-0microRNA是新近发现的一类长约19-25个核昔酸的内源性微小RNA,通过与靶mRNA的5'或3'端的非编码区互补结合而使靶mRNA翻译抑制或降解[1]。miR-126位于染色体9q34.3的宿主基因Egfl7（上皮生长因子-7）[2],在内皮细胞中特异性高表达，调节内皮细胞生

4、物功能的诸多方面，包括内皮细胞的增殖、迁移、细胞骨架的形成、毛细血管网的稳定以及细胞的存活等等，表明它是活体中维持功能性血管结构的前提，对血管新生起着至关重要的作用，展示了良好的应用前景[3-4]o本实验通过体外构建重组腺病毒miR-126,局部应用于小鼠缺血后肢，观察其在局部表达情况的变化，以及促缺血局部血管新生的作用，从而及早、有效的促进缺血后肢功能的恢复情况，探索miR-126基因治疗在临床上应用的可行性。1材料1.1实验动物：C57小鼠，雌性，12周，购于第四军医大学实验动物中心。1.2仪

5、器：显微外科手术器械、显微外科显微镜、酶标仪、电泳电源、电泳器材、转膜电源、半干转器材、滚筒架、发光仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统（美国UVP）、水平电泳槽、超净工作台、干燥消毒烤箱、紫外分光光度计、台式离心机、低温高速离心机。1.3试剂：CD31抗体（Abeam）、二抗（Elvision法）、DAB显色液、裂解液、ERK1/2抗体、、AKT抗体、pERKl/2抗体、pAKT抗体、转膜液、发光液（SantaCruz）.丽春红染料、封闭液、NC膜、电泳液、SDS凝胶试剂、GADPH、RT-PCR

6、引物合成（ABI,北京）、RNasin（Promega,美国）、M-MLV（Promega,美国）、SYBRRPremixExTaqTM（TaKaRa,日本）。2方法2.1重组腺病毒miRNA-126包装、纯化、滴度的鉴定:根据mus-mir-126的基因信息，设计上、下游引物如下：以小鼠基因组DNA为模板扩增mus-mir-126基因；全基因合成mus-mir-126基因至PES载体上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5CMV-IRES-GFP载体上；质粒扩增、鉴定及线性化；重组腺

7、病毒的包装；用滴定法测定重组腺病毒滴度。2.2实验动物分组：C57小鼠随机分为3组，每组12只:A组、C57左侧缺血后肢手术组；B组、空病毒C57左侧缺血后肢手术组；C组、重组腺病毒miRNA-126C57左侧缺血后肢手术组。1.3C57小鼠左后肢缺血模型的构建：在显微外科镜下，小鼠左侧腹股沟处暴露股动脉深、浅支，近、远端结扎，中间离断，缝合伤口。2.4给药方法：空病毒组、重组腺病毒miRNA-126组用lml注射器对左后肢腓肠肌局部注射,滴度为lX1090PU/ml,各50111,按组分笼喂养。

8、2.5检测指标：2.5.1大体观察：各组0〜14天末梢血运状况的观察。2.5.2组织学检测：7天、14天分别取左后肢腓肠肌组织，进行HE染色、血管内皮细胞的CD31染色，计算血管数目、密度。2.5.2.1石蜡切片常规HE染色。2.5.2.2CD31染色(Elivision法)：选取5um厚的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，压力锅进行抗原修复，灭活内源性过氧化物酶30min,10%山羊血清封闭液37°C温育15min,PBS冲洗，滴加稀释兔抗鼠CD31—抗(Abeam1：25