补肾生血药促进大鼠缺血后肢血管新生的实验研究

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1、补肾生血药促进大鼠缺血后肢血管新生的实验研究作者：梁天成黄家应向友刘勇苏松　【摘要】目的：探讨补肾生血药对缺血后肢大鼠外周循环中骨髓来源内皮祖细胞（EPC）的影响及缺血组织血管新生的影响。方法：建立大鼠后肢缺血模型，喂食补肾生血药，1周后细胞培养观察外周血EPC数量变化，4周后检测缺血组织微血管密度及血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。结果：实验组大鼠外周血培养的EPC（89.1±10.3/mm2）明显高于对照组（48.6±7.5/mm2)(P＜0.01)，缺血组织微血管密度（288.76±12.54）和VEGF表达（0.233±0.014）均高于对照组（22

2、4.84±5.87）,(0.162±0.018,P＜0.05)，且外周血EPC数量与微血管密度之间具有显著相关性（P＜0.01）。结论：补肾生血药通过动员骨髓EPC的迁移、分化、促进局部的血管新生，达到改善供血目的。【关键词】植物药疗法・缺血・四肢・内皮祖细胞・新生血管化，生理性・血管・内皮生长因子EffectofBushenshengxuetraditiondmedicineonangiogenesisofischemichindlimbsinrats【ABSTRACT】Obje

3、ctive:Toexploretheeffectoflimbischemiaonmobilizationofbonemarroictissueedicine.Methods:Unilateralischemicmodelofthehindlimbsonandsuperficialfemoralarteryin20malerats.Theother20animalsservedasthecontrolgroup.At1ononuclearcellsculture.Microvesseldensity,theVEGFexpressionandangiographofi

4、schemiclimbsberofcirculatingEPCsinexperimentgroup(89.1±10.3/mm2VS48.6±7.5/mm2,P＜0.01).Microvesseldensityofischemiclimbsm2VS224.86±5.87/mm2,P＜0.01).TheVEGFexpressioninexperimentgroupberofcirculatingEPCsicrovesseldensityandVEGFexpression(P＜0.01).Conclusion:Localperfusionofischemiclimbca

5、nbeaugmentedbyimprovingneovascularizationobilizationofbushenshengxuetraditionalmedicine.【KEY1.077A动物单核细胞分离液的界面上，密度梯度离心法分离，2000r/min，20min，吸出分离液与血浆之间的单核细胞层，PBS洗涤2次，加含15%胎牛血清的1∶1DMEMIMDM培养液混合，制成细胞悬液。将多聚赖氨酸处理后的2.0cm×2.0cm盖玻片置于6孔培养板中，调整细胞浓度为1×106，接种于6孔培养板内，每孔2.5ml。置37℃5%CO2孵箱内培养，2d后更换培养液，

6、弃去悬浮细胞，继续再培养2d。①细胞形态学：细胞培养4d后在倒置相差显微镜下观察活细胞的贴壁情况、细胞形态学变化。②细胞免疫化学检测：细胞培养后4d，取出盖玻片，PBS漂洗，95%冷乙醇固定，再次PBS漂洗，分别滴加第一抗体：兔抗鼠CD34多抗（1∶200），湿盒内4℃冰箱过夜。PBS振洗后，加入异硫氰酸标记的二抗50μl（FITCIgG），湿盒内37℃孵育1h，PBS洗涤后立即荧光显微镜下观察、摄片。阴性对照以PBS代替一抗。由2名观察者独立对每块盖坡片上的染色阳性细胞进行记数，随机选取5个视野，换上带有标尺的目镜，200倍视野下观察单位面积内阳性细胞数，取平均

7、值为单位面积EPC细胞数。将剩余的大鼠喂食至术后4周，处死，于缺血后肢内侧切取内收肌组织块，放入4%多聚甲醛（pH7.2）中固定24h，石蜡包埋，制成5μm厚组织切片备用。1.2.3微血管密度（MVD）及VEGF检测依照免疫组化ABC法，一抗分别为兔抗鼠Van非参数秩和相关性检验统计分析。2结果2.1大体观察所有大鼠均存活，造模10d后二组大鼠缺血后肢端均有毛发脱落、稀疏，毛皮发亮，两组共有5只出现趾端肿胀、坏疽、趾甲缺损脱落，10~14d后均坏疽脱落，创口自愈。2.2EPC体外培养观察外周血中的单核细胞接种5h后，部分细胞即开始贴壁，2d后贴壁的单核细胞逐渐伸长

8、变型，呈纺