生物化学实验8聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.ppt

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1、实验八SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离鉴定蛋白质技术二、原理电泳：带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率

2、）来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。泳动度（或迁移率）首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响。影响泳动速度的主要外界因素有溶液的粘度、电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象类别名称形式用支持物的电泳技术1．纸电泳2．醋酸纤维薄膜电泳3．薄层电泳4．非凝胶支持物区带电泳支持物有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶、合成树脂粉末5．凝胶支持物区带电泳（1）淀粉凝胶（2）聚丙烯酰胺凝胶

3、1）圆盘电泳2）平板电泳3）SDS-圆盘电泳（3）琼脂糖凝胶电泳（4）琼脂凝胶电泳包括常压、高压电泳(水平式或垂直式)水平式事垂直式(平板法、柱状法)垂直式(柱状法)垂直式或水平式垂直式(测相对分子质量)平板法或柱状法(如免疫电泳)表电泳技术的种类聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis

4、，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.

5、4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415–20104–1055-10105-2×1062-2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.

6、长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子

7、：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应图4电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质