实验5 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

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1、生物化学实验实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物103班1002040310赵宁宁搭档1002040301井恬一．研究背景及目的电泳现象是自然界存在的一个非常普遍的现象。瑞典科学加Tisellius依据电泳现象发明了电泳技术，使得根据大分子的特性分离纯化大分子物质技术得到了相当大的进步，他也由此获得了1948年的诺贝尔化学奖。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种比较普遍的电泳技术，采用聚丙烯酰胺作为电泳介质，主要分离纯化蛋白质等物质。同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。测定同

2、工酶在理论上和实践上都有重要的意义。过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。本是按采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶的同工酶，根据没的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本次实验我们将学习并掌握聚丙烯酰胺垂直板电泳技术，熟悉相关操作流程，并且通过分离检测研究过氧化物酶同工酶熟悉过氧化物酶同工酶的作

3、用机理。二．原理1.过氧化物酶同工酶同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。他们是DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶子啊理论上和实践上都有重要意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察，记录和保存。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中他的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶

4、的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳技术带点粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。由于带电胶粒或分子中的各种成分，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成分将按照各自的迁移速度得到有效的分离。电泳可分成三大类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。区带电泳是应用面最广，最重要的电泳实用技术。区带电泳是指胶体在各种不同的惰性支持物中进行电泳，不同组分形成带状区间。正因为支持介质的存在，减少了界面异常现象干扰和样品的扩散程度，所以适于分离鉴定氨基酸

5、、核苷酸等小分子，以及蛋白质、核酸等大分子物质。区带电泳一起简单，操作方便，分辨力高，目前根据常用的支持物介质的不同物理性质，答题可以分为四类：滤纸及其它纤维薄膜电泳、凝胶电泳、分膜电泳和线丝电泳。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duet

6、omissedfatal,whennightcame本次试验采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，属于凝胶电泳的一种。聚丙烯酰胺凝胶电泳实用性最强，凝胶机械性能好、有弹性、透明、化学上稳定、对pH和温度变化不敏感、为非离子型、没有吸附和电渗作用等，尤为突出的是实验中所需样品量小（1-100μg），而分辨率又高。还可以通过改变浓度和交联度来控制不同大小的凝胶孔径，取得更好的分辨效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳已被广泛应用与许多学科中，在日常样品分析、分离、纯度鉴定、分子量测定中，是一个很有价值、有时甚至是不可缺少的技术。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acry

7、lamide，Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-MethylenaBisacrylamide，Bis），在催化下聚合而成的。Acr和Bis在他们单独存在以及混合时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时，他们就聚合，引发产生自由集团的方法有两种，即化学法和光化学法。光聚合法形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定个，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适，采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过

8、甲叉桥联接起来。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象几位微笑。以上特点