实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)

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1、实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5-1厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。而同工酶是指能催化同一种化学反应，但

2、其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作

3、为鉴定植物的种间杂交,特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较

4、分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。二、实验原理1、电泳现象。带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象成为电泳。电泳现场常受到带电粒子的实际电荷，大小及形状，解离度等因素的影响，因其环境的不同，又表现为受电解质或缓冲液浓度、离子强度、pH、粘度、温度以及电场强度等因素的综合作用。但在支持介质中，电泳的结果往往取决于介质的选择，即电泳受介质性质的影响，例如介质的化学惰性、化学稳定性，均一性以及电渗性质等。2、凝胶电泳的载体选择凝胶电泳的介质选择至关重要，

5、而电泳的结果也往往取决于该介质的性质。本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳。聚丙酰胺凝胶电泳是区带电泳的一种。而区带电泳是胶体在惰性支持介质中进行电泳，不同组分形成带状区间。支持介质的存在减少了界面异常现象的干扰和样品的扩散，适用于7生物分子的分离和鉴定。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂条件下聚合而成。在小分子量电泳实验中，常采用化学聚合法制备凝胶，所用的引发剂为过硫酸铵（Ap），催化剂为四甲基乙二胺（TEMED）。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成

6、的长链，链与链之间通过甲叉桥连接起来，形成纵横交错的三维结构，使凝胶具有分子筛的性质。聚丙烯酰胺凝胶可以通过改变浓度和交联度来控制不同大小的凝胶孔径，取得更好的分辨效果。其中，聚丙烯氨酰胺凝胶的机械性能好、有弹性、透明、化学上稳定、对pH和温度变化不敏感、没有吸附和电渗作用，且实验所需样品量小，分辨率高，因此是最为常用的支持介质。而采用垂直板电泳，是因为电泳胶板的表面积大，不与缓冲液直接接触，易于冷却控温，且能够在同一胶板、同一操作下同时比较多个样品，便于进行各种鉴定。本次电泳的凝胶系统为不连续系统，即凝胶板分为上层的

7、浓缩胶和下层的分离胶，且缓冲液离子组成和各层凝胶的pH不同。在不连续系统中的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应的共同作用下，待测物质能够很好的分离开来，系统的分辨率较连续系统大大提高。因此，实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳来实现小麦中过氧化物酶同工酶的分离。3、凝胶系统聚丙烯酰胺凝胶电泳是不连续的凝胶系统，其不连续性表现在上下凝胶层的不同组成导致的凝胶浓度和交联度差异，不同凝胶缓冲液导致的凝胶层pH值不同，以及由于pH不同导致的在电场中形成了不连续的电位梯度。在这个不连续的凝胶系统里，存在着三种物理效应，即电荷效应

8、、分子筛效应以及浓缩效应，物质的分离主要是在这三种效应的作用下实现的。电荷效应：各种酶蛋白按其所带有的电荷种类以及数量，在电场作用下以一定的速度向一定电极。分子筛效应：分子量小、形态为球形的分子在电泳中受到的阻力较小，移动速度快，反之则移动较慢。这与凝胶过滤系统中的分子筛效应是不同的。浓缩效应：待分离样品中的各组分在凝胶中会被压缩