生化实验03斐林试剂比色法测还原糖含量.ppt

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1、实验03植物组织中还原糖含量的测定（斐林试剂比色法）1脱色的程度与溶液中还原性糖含量成正比关系。在590nm波长下比色测定吸光度，根据吸光度的减少值查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。一、原理植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有自由的醛基和酮基，具有还原性。在碱性、加热条件下，还原基团能把斐林试剂中CuSO4的Cu2＋还原成Cu＋，生成Cu2O红色沉淀，蓝色的斐林试剂溶液因失出部分Cu2＋而脱色。2材料：新鲜植物叶片仪器设备：分光光度计、分析天平、低速离心机、水浴锅等试剂：1.斐林试剂A液：

2、40gCuSO4·5H2O溶解于蒸馏水定容至1.0L。2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1.0L。A、B两液分别贮存，使用前按1：1体积混合。（已配好）二、材料、仪器设备及试剂30.1％葡萄糖标准液烘干的纯葡萄糖100.00mg，加蒸馏水溶解定容至100ml浓度：1.00mg/ml（已配好）斐林试剂（蓝色）Cu2O砖红色不溶于水4三、实验方法与步骤1.标准曲线的制作取5支试管编号，按下表分别加入各试剂。项目123451.标准葡萄糖液（ml）0.002.004.006.00样品液6ml2.

3、H2O(ml)6.004.002.000.000.00每管葡萄糖含量(mg)0.002.004.006.00待测3.斐林试剂量(ml)4.004.004.004.004.00A590值A1A2A3A4A5吸光值差值(ΔA590)A1-A1A1-A2A1-A3A1-A4A1-A55处理方法：加斐林试剂后摇匀，加盖沸水浴中15min，自然冷却转入离心管，平衡后放入离心机！！离心：2500r/min5min小心取出，取上清液测吸光值6标准曲线绘制：以葡萄糖量(mg)为横座标，吸光度差值(ΔA590）为纵座标，在座标纸上绘制出标准曲线。比色测定：用H2O作调0空白参比

4、液！在590nm波长下测定各管的吸光度。ΔA590葡萄糖mg073.0～4.0g样品—→加水研磨成匀浆后转入50ml大试管—→80℃水浴20min（间歇震荡）—→冷却后转入100ml容量瓶定容、过滤后得到待测溶液。取待测液6.0ml进行测定（按制作标准曲线的步骤）。2样品还原糖提取与测定8W=g；VT=100ml;Vs=6ml;A590及ΔA590填入工作曲线表作式作曲线图由工作曲线查得样品的还原糖含量为C=?mg四、数据记录9样品还原糖的含量（%）＝五、结果计算（X：根据标准曲线查得的糖质量mg；VT：提取液总体积（mL）；W：样品鲜质量（g）；Vs：测定时

5、取用的样品体积（mL）；N：样品稀释倍数）102种温度水浴处理，不可弄混离心机使用注意安全。思考：比较双缩脲试剂与斐林试剂的差异？思考：比较本实验与蛋白质测定实验中的化学原理差异？注意事项与思考：11