可控相转变温度热敏高分子的制备及其在免疫分析中的应用.pdf

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1、第31卷分析化学（FENXIHUAXUE）研究报告第1期2003年1月ChineseJournaIofAnaIyticaIChemistry1~4"!!!!!!!!"!研究报告!!"!!!!!!"!可控相转变温度热敏高分子的制备及其在免疫分析中的应用林鹏1郑洪2张长弓3杨黄浩1李东辉3许金钩#1（厦门大学化学化工学院分析科学教育部重点实验室1，厦门大学海洋与环境学院2，厦门大学抗癌研究中心3，厦门361005）摘要合成了一种新型的快速响应热敏高分子聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺［P（NIP-co-AA）］，通过改变丙烯酰胺的含量可

2、以改变高分子的临界溶解温度（LCST），使之用于不同用途。其中，将相转变温度（!tr）在37C的热敏高分子用于免疫分析的载体，建立了夹心型荧光免疫分析兔IgG的新方法。与聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIP）作载体相比，两者灵敏度相当，但由于相转变温度的提高，使得免疫反应的温度更接近于生物体的生理环境，并使免疫反应速率得到提高。该方法线性范围为0~1000!g/L；检出限为10!g/L。用于兔血清中兔IgG的测量，结果令人满意。关键词温度敏感高聚物，热敏相分离，荧光免疫分析!引言［1］聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIP）温度敏感高分子因其独

3、特的温度敏感性而应用于控制释放、酶的固［2］［3］［4~9］定化、循环吸收和免疫分析等领域。它有一个固定的较低临界溶解温度（LCST，约30~31C）或称相转变温度（!），这使得它的应用受到一定限制。例如，控制释放时，必须在LCST附近进行，当外界tr要求在较高温度释放时不能调整!，以致不可能控制。将PNIP用于免疫分析兼具均相免疫反应的快tr速性和异相免疫反应的高灵敏度，但是免疫反应的温度必须控制在PNIP的LCST以下，这样会不可避免地影响反应速率。此外，由于相转变温度较低，夏季室温较高，均相测量荧光时，高分子极易析出，导致［

4、10］荧光测量不准确。我们曾经尝试合成了pH敏感高分子，将N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸共聚，37C时在相转变pH值5.6附近发生沉淀与溶解的可逆性变化，这样可以通过调节pH使得免疫反应在较高温度发生。本实验室将N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酰胺共聚，合成了另外一种新型热敏聚合物，具有较高的［1，3］LCST，且其!tr可以通过两种单体的比例进行调节，在控制释放和循环吸收等领域可通过简单的配比［11］调整合成出一系列不同用途的高分子。此外，该高分子敏感性较强，溶解、沉淀速率比较快。将其用于免疫反应，不通过调节酸度同样可以使得免疫反应在3

5、1C以上进行。在免疫反应中考虑到沉淀时温度过高易使抗原抗体受到不同程度的破坏，!也不能无限提高，因此合成出相转变温度在37C的热敏tr高分子载体，可在33C时进行免疫反应，40C时进行沉淀分离，用作免疫反应的载体，建立了兔IgG的热敏相分离荧光免疫分析方法，测定灵敏度与固相法相当，但由于反应温度提高，反应平衡时间只需5min。"实验部分"#!仪器和试剂650-10S型荧光分光光度计（日本日立公司）；DU-7400型紫外-可见分光光度计（美国Beckman公2002-03-18收稿；2002-09-23接受本文系教育部博士点基金（2

6、00003840）和福建省自然科学基金（00110002）资助课题2分析化学第31卷司）；TGL-16G型低温高速离心沉淀机（上海安亭科学仪器厂）；S~Z-88台式水浴恒温震荡器（江苏太仓市实验设备厂）。N-异丙基丙烯酰胺（NIP）和N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED，分析纯，日本东京Kasei公司）；丙烯［12］酰胺（AA，分析纯，Sigma公司）；N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯（NAS）按文献合成；异硫氰酸荧光素（FITC，色谱纯，上海化学试剂公司）；牛血清白蛋白（BSA，电泳单点纯，上海长阳生化制药厂）；兔IgG和羊抗兔I

7、gG抗体（厦门大学抗癌中心）；自制FITC标记羊抗兔IgG抗体复合物（Ab-FITC），标记比（F/P）为1；葡聚糖凝胶G-50、透析袋（上海华美生物工程公司）。所用水为三次重蒸去离子水。2.2实验方法2.2.1热敏高分子P（NIP-co-AA）和P（NIP-co-AA）-抗体偶联物的制备称取NIP104mg，溶于5mL磷酸生理盐水（PBS，p~=7.4），然后加入一定量的AA，再加入5mg过硫酸铵（APS）和20，混合!LTEMED均匀后，置于25C水浴中恒温振荡21后，转移至40C水浴中振荡10min，40C空气浴中高速离心5

8、min（转速4000r/min），倾掉上清液，加入冰冷的PBS溶解，然后重新在40C水浴振荡10min，高速离心，如此重复3次，最后将沉淀溶于PBS中，4C下保存备用。将羊抗兔IgG抗体300，加到1.7mL的PBS中，再加入200（0.1%）溶液