基因工程ev71疫苗研究

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1、基因工程EV71疫苗研究郑海发北京民海生物科技有限公司2016年06月报告内容研究背景研究现状研究内容重组表达菌株的构建及筛选工艺研究基因工程疫苗研究的质量研究检验方法及标准交叉保护及免疫保护性研究三维结构研究研究背景肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是引起婴幼儿手足口病（HFMD）的主要病原体之一，同时还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重威胁儿童的生命健康。2008-2015年，我国共报告HFMD约1380万例，平均年发病率为147/10万，报告重症病例约13万例

2、，死亡3300多人。在现有医疗干预和救治措施下，对于EV71感染相关重症病例尚无特效治疗药物，只能采取对症、支持治疗。疫苗接种是预防EV71感染的有效措施。3研究背景1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来。4研究背景微小RNA病毒科，肠道病毒属，单股正链RNA病毒。无外壳、正20面体、直径24-30nm。病毒粒子的衣壳由60个亚单位组成，每个亚单位由4个衣壳蛋白（VP1-VP4）拼装成五聚体样结构。5研究背景EV71流行在时间上呈一定的周期性：其中有4次大流行：1975年保加利亚、1978年匈牙利、1997年

3、马来西亚和1998年中国台湾。我国从2008年至今EV71持续流行。发病及死亡病例均居丙类传染病首位研究现状序号疫苗研发单位表达系统研发进度1NHRI杆状病毒临床前2Maryland/USA杆状病毒临床前3中山大学毕赤酵母临床前4工业大学啤酒酵母临床前5军科院/宁夏医科大学杆状病毒临床前6上海巴斯德所/华兰生物杆状病毒/酵母临床前7上海泽润酵母临床前8吉林百克杆状病毒临床前7研究内容重组表达菌株的构建及筛选工艺研究基因工程疫苗研究的质量研究交叉保护及免疫保护性研究三维结构研究研究内容EV71毒株各基因型/亚型分布基因型流行地区流行时间A

4、美国1970B1美国、澳大利亚、中国台湾、凶利亚、保加利亚、日本1972-1987B2美国1981-1987B3马来西亚、澳大利亚、新加坡1997-1999B4马来西亚、新加坡、中国台湾、日本1997-2002B5马来西亚2003C1美国、澳大利亚、马来西亚、新加坡、越南、泰国、日本1986-2005C2美国、澳大利亚、日本、中国台湾1995-2002C3中国、韩国1997、2003C4中国、越南、日本、中国台湾1998—C5越南20059研究内容我国主要EV71疫苗毒株遗传特点研究VP1(297aa)位点疫苗株522868898104145237

5、2822891AHRGEDLTNA2AHRGENETNA3AHRRENGNNT4PQIGKNETNT5AHRGENQTDA6AHRGKNETNAminhaiAHRGENETNA10研究内容重组表达菌株的构建及筛选P1、3CD基因序列优化情况：P1：2592bp，862个氨基酸，568个核苷酸改变。3CD：1944bp，646个氨基酸，435个核苷酸改变。SacI酶切XhoI连接SalI酶切SacI11研究内容重组表达菌株的筛选及鉴定（a）：P1基因PCR鉴定（b）：3CD基因PCR鉴定P13CD1、3、5-14：重组菌株2：空质粒转化菌株4：P1

6、基因转化菌株SDS-PAGEWesternblot12研究内容工艺研究阶段结果纯化过程样品SDS-PAGE检测发酵过程样品WB检测原液SDS-PAGE及WB检测13研究内容工艺研究阶段HPLC纯度检测粗纯PBS一步层析二步层析14研究内容基因工程疫苗研究的质控新方法透射电子显微镜动态光散射技术差示扫描量热技术高效毛细管电泳技术圆二色谱法15研究内容透射电子显微镜重组EV71疫苗的活性成分是病毒样颗粒，直径约30nm左右，透射电镜可观察其颗粒大小、形态、是否发生颗粒聚集或颗粒崩解等重要信息，亦可用统计学方法考察样品中粒径的均一性和不同

7、生产批次间粒径的稳定性。16研究内容动态光散射技术动态光散射技术可用于测量溶液中颗粒的大小和分布，其测量范围一般是1nm〜1μm，包括了疫苗中病毒样颗粒的大小尺度，因此可以用动态光散射技术对疫苗原液中的病毒样颗粒进行检测，可获得溶液中的颗粒大小和分布，从而反映疫苗的颗粒纯度。进一步分析溶液颗粒组分的峰散度还可获得颗粒的均一性，判断颗粒是否发生聚集或解聚，可通过多批次疫苗原液测量结果分析疫苗生产工艺的稳定性。17研究内容差示扫描量热技术差示扫描量热（differentialscanningcalorimetry，DSC）技术是一种在程序控温下测量物

8、质的物理性质热量变化和焓的变化随温度变化的一类技术，即通过程序控制温度的变化，在温度变化的同时，测量试样和参