基因工程：第六章2-PPT精选文档.ppt

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1、上述方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质；经两项轻微的改良后，也可以用来检测非分泌的蛋白质。第一种改良方法是：采用对cI857噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞作寄主，它含有在42℃下会发生热失活的热敏感阻遏物。把生长着待检测菌落的原培养基平板，影印到加有抗体的琼脂平板上，等到影印平板中的菌落长到肉眼可以辨认的大小时，将培养温度上升到42℃，经过1h之后，平板中就会有许多细胞被热诱导发生溶菌作用。于是细胞的内含物便被释放出来，分布在周围的培养基中，其中目的基因编码的蛋白质就会同加在培养基中的抗体发生反应，并在菌落的周围形成一圈沉淀素带。第二种改良方法是：将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心地倾注到

2、菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，处于菌落表面的细胞发生溶菌反应，逐步地释放出细胞内部的蛋白质。如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，形成沉淀素圈。6.4转译筛选法转译筛选法可分为杂交阻断转译法（HART）和杂交释放转译法（HRT）两种不同的筛选策略。它们的突出优点是，能够将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。这两种方法都要通过无细胞转译系统检测经处理后的mRNA的生物学功能，常用的有麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。6.4.1杂交阻断转译法（HART）这种方法又称杂交抑制的转译筛选法，其依据的原理是：在

3、体外无细胞的转译体系中，mRNA一旦同DNA分子杂交之后，就不能够再指导蛋白质多肽的合成，即mRNA的转译被抑制了。在高浓度甲酰胺溶液的条件下（这种溶液既有利于DNA-RNA的杂交，同时又能抑制质粒DNA的再联合），将从转化的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体中制备来的带有目的基因的重组质粒DNA，变性后同未分部的总mRNA进行杂交。从杂交混合物中回收的核酸，加入到无细胞转译体系进行体外转译，由于其中加有35S标记的甲硫氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。并把其结果同未经杂交的mRNA的转译产物作比较，从中便可以找到一种其转录合成被抑制了的mRNA，这

4、就是同目的基因变性DNA互补而彼此杂交的那种mRNA。根据这种目的基因编码的蛋白质转译抑制作用，就可筛选出含有目的基因的重组体质粒的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体。阻断转译杂交法是一种很有效的检测手段，它能从总mRNA逆转录产生的cDNA群体中检出所需要的目的cDNA，因而特别适用于那些高丰度的mRNA。6.4.2杂交释放转译法（HRT）这种方法又称杂交选择的转译筛选法，是一种更为敏感的方法，而且可以检出低丰度的mRNA（占总mRNA的1‰），它与阻断转译杂交的原理相似。其主要程序是：首先将克隆DNA结合到硝酸纤维素滤膜上，再与未经分离纯化的mRNA或细胞的总RNA杂交；然后漂洗滤膜，在低盐

5、缓冲液或甲酰胺的缓冲液中加热，把杂交的mRNA洗脱下来（即把mRNA释放出来）；再用回收的mRNA进行体外转译试验，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分析鉴定转译产物，同时亦可测定蛋白产物的生物活性，以达到筛选所需基因的目的。6.5物理筛选法6.5.1凝胶电泳筛选法带有插入片段的重组体在分子量上会有所增加，因而一种直截了当的方法是分离质粒的DNA并测定其分子长度。对此，电子显微镜是有效的方法，但过于繁琐，通常用操作程序比较简单的凝胶电泳法进行检测。由于质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的，根据在凝胶中迁移速度的差别，即可鉴定出含有外源DNA插入序列的重组体菌落。有些假阳性转化菌落（

6、如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个互相连接的载体，以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落），用平板法筛选是无法鉴别的，但可以被电泳法淘汰。因为由这些转化菌落分离的质粒DNA分子的大小各不相同：和真正的阳性重组体DNA比较，前三种重组DNA分子较小，在电泳时的泳动率较快，其DNA带的位置跑在阳性重组DNA带的前面；后两种重组DNA分子较大，泳动率较慢，其DNA带的位置跑在阳性重组DNA带的后面。所以电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体。如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，对于这样的假阳性重组体，电泳法仍不能鉴别，只有进一步用Southernblot杂交，即以目的基因片段制备的

7、放射性探针和电泳筛选出的重组体DNA杂交，才能最终确定真阳性重组体。6.5.2R-环检测法R-环指的是RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构（被取代的原DNA链在杂交区呈突出的环状）。R-环的形成是因为：在70%甲酰胺溶液中，当接近DNA变性温度时，杂交双链DNA-RNA分子比双链DNA-DNA分子更稳定。因此，仔细控制形成R-环的条件，将RNA