葡聚糖检测方法.docx

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1、葡聚糖检测方法（试剂盒方法翻译）一．提供试剂瓶1：exo-1,3-β-Glucanase(100U/mL)plusβ-Glucosidase(20U/mL)suspension,2.0mL瓶2：Amyloglucosidase(1630U/mL)plusinvertase(500U/mL)solutionin50%v/vglycerol,20mL瓶3：GOPODReagentBuffer.Buffer(48mL,pH7.4),p-hydroxybenzoicacidandsodiumazide(0.4%w/v).瓶4：GOPODReagentEnzymes

2、.Glucoseoxidaseplusperoxidaseand4-aminoantipyrine.Freeze-driedpowder.瓶5：D-Glucosestandardsolution(5mL,1.00mg/mL)in0.2%w/vbenzoicacid瓶6：Controlyeastβ-glucanpreparation(2g,β-glucancontentstatedonthebottlelabel).二．提供试剂的处理1.向瓶1中加入8ml醋酸钠缓冲液，分装-20℃存放。2.直接使用瓶2中的试剂，稳定在4°C~2年或者-20°C>4年。3.将

3、瓶3的GOPOD试剂用纯化稀释水定容到1L，稳定在4°C>2年。4.将瓶4的GOPOD试剂用纯化稀释水定容到1L，黑暗环境存放，稳定在4°C2-3个月,在-20°C或>12个月。1.直接使用瓶5中的试剂，在室温下稳定>4年。2.直接使用瓶6中的试剂，在室温下稳定>5年。一．未提供试剂的制备（缓冲液的配置）1.醋酸钠缓冲液(200mM,pH5.0)在900ml去离子水中加11.6ml冰醋酸(1.05g/mL)，用4M氢氧化钠(16g/100mL)调节ph=5.0，4℃存放。2.醋酸钠缓冲液(1.2M,pH3.8)在800ml去离子水中加入69.6ml冰醋酸，

4、用4M氢氧化钠(16g/100mL)调节ph=3.8，室温存放。3.氢氧化钾(2M)在800ml去离子水中加入112g氢氧化钾溶解，室温保存。4.盐酸(37%v/v;~10M)在室温下稳定>10年二．检测空白试剂的配置1.试剂空白0.2ml醋酸钠缓冲液(200mM,pH5.0)，再加入3mlGOPOD试剂。2.葡萄糖标准0.1ml葡萄糖标准溶液（1mg/ml）和0.1ml缓冲液(200mM,pH5.0)再加入3.0mlGOPOD试剂溶液。三．测量1、3:1、6-β-GLUCAN，待测样品的准备工作A：测量总葡聚糖1.粉碎待测样品。过20-30目筛。1.准确

5、称取100mg粉碎的待测样，到培养管，保证样品沉到培养管底部。2.向培养管中加浓盐酸(37%v/v)，封口，使用漩涡混合器充分混合。置30℃水浴锅中水浴45min，每15分钟混合一次（保证完全溶解样品）3.在每个培养管中加入10ml去离子水，混合均匀。4.在100℃沸水浴中培养2h。5.冷去至室温，加入10ml氢氧化钾(2M)。6.用醋酸钠缓冲液(200mM,pH5.0)定容至100ml，冲洗培养管，混合均匀。7.1800r/min,离心10min，得离心液。8.移取0.1ml离心液到试管（俩份）。9.加入0.1ml瓶1的处理液，并在40℃水浴1h。10.

6、加入3mlGOPOD试剂，在40℃下水浴20min。11.测量在510nm的吸光度。B：α-Glucan的含量测定1.准确称取100mg粉碎的待测样，到培养管，保证样品沉到培养管底部。2.加入2M氢氧化钾溶液2ml，冰浴搅拌混匀20min。3.添加8毫升1.2m醋酸钠缓冲(pH=3.8)搅拌。立即加入0.2ml瓶2试剂，搅拌均匀，在40℃水浴30min，间歇使用涡旋混合器混合。4.样品包含>10%α-glucan时，将上述溶液转移到100毫升容量瓶(使用洗瓶水)定容，混合好，1800r/min,离心10min。1.样品包含<10%α-glucan时，这样的

7、样品大约是最后的体积10.3毫升，1800r/min,离心10min（无稀释）2.移取0.1ml离心液到试管（俩份）。3.加入0.1ml瓶1的处理液，加入3mlGOPOD试剂，在40℃下水浴20min4.测量在510nm的吸光度。一．计算公式以及说明总葡聚糖(%w/w)=ΔExF/Wx90.α-葡聚糖(%w/w)=ΔExF/Wx90(finalvolume100ml)=ΔExF/Wx9.27(finalvolume10.3ml)β-Glucan=TotalGlucan-α-Glucan备注：ΔE=样品OD-空白ODF=?W=样品称取质量