β-葡聚糖测定方法.doc

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1、6.2交联β-葡聚糖含量测定AACC32-236.2.1实验目的在大麦、麦芽、麦芽汁和啤酒产品质量控制中经常需要测定其中的β-葡聚糖含量，Megazyme方法很好的解决了测定中的系列问题，本方法能够在一天内测定50-100个样品。本方法现在也适用于燕麦产品及燕麦纤维产品β-葡聚糖含量测定。6.2.2实验原理样品水化后加入真菌多糖酶在pH6.5缓冲液中培养，提取液离心（或过滤）后加入β-葡萄糖苷酶，在葡糖糖氧化－过氧化酶缓冲液保护下产生葡萄糖。图6.1葡聚糖测定原理示意图Megazyme测试包：（可以测定100个样品）⑴全套测定方法；⑵真菌多糖酶；⑶β

2、-葡萄糖苷酶；⑷葡糖糖标准液；⑸大麦和燕麦纤维标准样品。6.2.3实验试剂：⑴真菌淀粉酶（bottle1）〔（1-3）（1-4）β-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶〕：（活力>1000U/mL）制备：1.0mL真菌淀粉酶用20mMNaH2PO4缓冲液（pH6.5）稀释至20.0mL。将溶液分装成5.0mL在冰箱中冷冻保存。最终真菌淀粉酶浓度50U/mL。⑵β-葡萄糖苷酶（bottle2）：（活力>40U/mL）制备：将1.0mLβ-葡萄糖苷酶用50.0mM醋酸钠缓冲液（pH4.0）稀释至20.0mL。将溶液分装成5.0mL在冰箱中冷冻保存。最终β-葡萄糖苷

3、酶浓度2U/mL。⑶葡糖糖标准液：100μg0.1mL，用0.2%叠氮化钠溶液溶解。⑷大麦标准样品：含量见标签。⑸燕麦纤维标准样品：含量见标签。⑹NaH2PO4缓冲液制备（20mM，pH6.5）：3.12gNaH2PO4－2H2O溶解于900ml蒸馏水中，用100mM氢氧化钠溶液（4g/L）将pH值调至6.5（大约需50mL），加0.2g叠氮化钠，将溶液定容至1L。4℃保存。⑺醋酸钠缓冲液（50mM，pH4.0）：饱和醋酸（2.9mL）加入900mL蒸馏水，用1M氢氧化钠调节pH值至4.0，加0.2g叠氮化钠，将溶液定容至1L，4℃保存。⑻葡萄糖氧化

4、－过氧化酶缓冲液：建议使用Megazyme测试包里的高纯度葡萄糖氧化溶液和葡糖糖过氧化酶。将测试包的葡萄糖工作液（bottle3）（50mL）稀释至1L。把测试包中的葡萄糖测定液（bottle4）用1L葡萄糖工作液溶解（简称GOPOD）。为了保证GOPOD溶液的稳定性，应该在低温条件下在棕色瓶中避光保持。测定过程中从冰箱中取出的凉的GOPOD溶液可以直接加入测定管。葡萄糖工作液包括：CaHPO4－2H2O（136.0g），NaOH（42.0g），酸（30.0g），叠氮化钠（4.0g）。6.2.4仪器需求：⑴聚丙烯具塞试管（35mL）；⑵移液器：量程分

5、别为100μL，200μL，5.0mL（用于Na2HPO4缓冲液和葡萄糖氧化－过氧化酶缓冲液），25mL（用蒸馏水）。⑶顶载天平：1/1000g。⑷漩涡混合器；⑸分光光度计：510nm。⑹水浴锅：40℃和100℃水浴锅各一个。⑺秒表：一只。⑻离心机：离心力100g。⑼试验粉碎机：细度0.5mm。6.2.5测定步骤：⑴将燕麦用试验粉碎机粉碎成细度0.5mm的颗粒。⑵仔细称量燕麦粉样品（0.5g左右），放入35mL聚丙烯具塞试管。样品需要已知水分含量，以便最后转为干基。⑶向试管中加入1.0mL50%（v/v）的乙醇溶液，使样品充分润湿。⑷加入5.0mLN

6、aH2PO4缓冲液（20mM，pH6.5），在漩涡混合器上充分混合。⑸将试管放入100℃水浴锅中保温5min。每隔0.5min取出快速在漩涡混合器上混合。前2.0min加热及混合效果对于结果影响较大。⑹将试管在室温下降至40℃，向每个试管加入0.2mL真菌淀粉酶（10U）。试管加盖，震荡混匀，放入40℃水浴锅中保温1h。每隔10min将样品在漩涡混合器上混合。⑺向每个试管加入24mL蒸馏水，将溶液体积调整为30mL。⑻将试管放入离心机中，在1000g离心力下离心10min。⑼用移液枪移取0.1mL样品液，分别放入3个玻璃试管。一个玻璃试管作对照，另外

7、两个为代测样品。⑽按如图6.1所示加入试剂。黑色方框为比色杯。一次可以同时完成11个样品的测试。⑾将玻璃试管放入40℃水浴锅中保温15min。⑿向每支试管加入3.0mLGOPOD溶液，在40℃水浴锅中保温20min。葡萄糖标准液对照测试样品醋酸钠缓冲液葡萄糖标准液葡聚糖酶样品液蒸馏水图6.2葡聚糖测定试剂及样品添加示意图⒀将试管中液体转入1.0cm比色杯，在510nm测定吸光度。1h内完成测定。⒁计算β-葡聚糖含量：样品干重＝样品重量×（100-水分含量）/100β-葡聚糖含量（％w/w）＝吸光度×F×300×（1/1000）×（100/W）×（16

8、2/180）＝吸光度×（F/W）×27F＝100/葡糖糖标准溶液吸光度；300为体积校正系数；162/180