转录因子ikaros调节垂体prl表达机制的研究

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1、·l354·；2010年9月第27卷第9期ChinJExpSu，September2010．Vo1．27．No．9·简手艮·转录因子Ikaros调节垂体PRL表达机制的研究于顺江陈怡东王京垂体瘤是常见的神经内分泌肿瘤。别取样50g沸水煮后装载12％SDS—珠充分混合，4摇动过夜，以未加抗体其中，功能性垂体腺瘤约占70％，临床表PAGE胶进行电泳、转膜，以5％脱脂牛奶的共沉淀样本作为阴性对照，以抗AcH3现为泌乳素(PRL)、生长激素(GH)和促封闭，然后与抗rPRL(1：8000)孵化，4℃或抗Pit一1抗体进行蛋白印迹分析或聚肾上腺皮质激素(ACTH)等激素过度分摇动过夜。次日以0．05％

2、PBS—Tween一20合酶链反应(PCR)分析。进行PCR时，泌所致多种内分泌严重失凋如身体发育室温洗膜后加入二抗(羊抗鼠，1：1000)室所用引物如下：rPRL正向，(5’一GCAAT-异常、不孕不育、严重心血管疾病等。目温摇动1h，以ECL化学发光法进行底物GGCACACATTGcAGA一3’)，反方向(5’．前垂体瘤的发生机制仍不清楚，可能与反应，以B—actin抗体(1：500)校正装载蛋AGTCCTAAGAGAACCACTGC一3’)，对应垂体多种基因表达失控有关0。业已鉴白样品(内对照)。于PRL启动子核苷酸364bp节段。别几个公认的转录调节蛋向在垂体激素4．质粒构建和细胞转

3、染：鼠全长Pitl二、结果分泌调节中非常重要J，其中Ikaros在表达载体及其空白质粒pcDNA3．1则由1．Ikaros调节PRL基因的表达：先垂体内分泌系统发育及垂体肿瘤形成过多伦多大学H．Elshohz教授提供。表达前的研究显示Ikaros可在垂体前叶组织程中起至关重要的作用J。本研究旨在Ik一1和Ik一6的质粒及其空白质粒中表达。GH4细胞经过转染野生型探讨Ikaros调节垂体激素分泌的作用PcDNA3．1则由哈佛大学K．GeorgopoulosIkaros(1k1)或不具有与DNA结合能力机制。博十和多伦多大学Ezzat教授惠赠。所的同T蛋白Ik6后，Northernblot显示外

4、一、材料和方法有表达载体结构的方向和核酸序列则通源性表达的Ikaros诱导了PRL基因的1．细胞培养：鼠的垂体GH4细胞株过限切酶和测序证实。转染前均以mRNA表达，Westernblot印记也证实了来源于ATCC生物制品公司。GH4细胞QiaGenMaxi—Prep试剂盒提取DNA。以Ikaros能诱导PRL蛋白的表达。为了进常规培养于含100u／rnl青霉素，100mg／LLipofectamine法对GH4细胞进行转染，以一步澄清Ikaros对PRL基因调节的作链霉素，2mmol／L／glutamine和含10％G418进行稳定克隆筛选。rPRL启动子的用，经Ikaros转染的GH4细

5、胞种植于胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃含活动({~：422bp节段)则由pSV2A—rPRL—lucSCID鼠皮下并生长2周后，免疫组织化5％CO，的培养箱中培养，常规8～l0代转然细胞后进行测定。转染48h后溶解学分析显示Ikaros表达后能够上调PRL传代培养后接种于100mm培养皿贴壁细胞，测荧光素酶的活动。为搞清染色的表达，而Ik6则不能。为了弄清Ikaros生长，取指数生长期细胞进行实验。稳质的乙酰化作用，GH4细胞转染后以对PRL基因表达调节的机制，以PRL启定表达的野生型Ikaros(Ik1)和其蛋白同200LLg／L的Trichostatin—A处理细胞16动子报告基因

6、(PRL—Luc)和Ikl或Ik6表型Ik6的细胞克隆株采用G418进行h，然后进行荧光素酶发光测定以评价达质粒共转染GH4细胞后发现Ikl能使筛选。PRL启动子的活动。每个试验至少重复PRL基因启动子活动增加，而Ik6则无此2．总RNA提取和Northernblot分3次。作用。析：用Trizolkit提取鼠GH4细胞和人垂5．免疫组织化学分析：稳定转染2．Ikaros改变了PRL启动子的乙酰体组织总RNA。取2．5txgRNA样本装Ikl、Ik6或其空白载体的GH4细胞被注化作用：已证实PRL启动子无Ikaros结载于1％甲醛一琼脂糖胶进行电泳，然后入SCID鼠皮下(5×10。细胞)。2

7、周后，合位点，Ikaros不能与PRL启动子直接转移至尼龙膜，以P—dCTP标记探针处死小鼠取组织进行相应的免疫组织化结合。通过ChIP检测PRL启动子的(rPRL的cDNA片段，如前描述)进行学分析。乙酰化状态。Ikl转染后的表达导致杂交。以GAPDH(cDNA长度为687bp)6．染色质免疫共沉淀(ChIP)试验：PRL启动子上组蛋白一3的乙酰化作用。标记的探针作为内对照。以rPRL—luc(422bp)