蛋白A连续床亲和毛细管色谱柱的制备及性能考察.pdf

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1、Vo1.23高等学校化学学报No.112002年11月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES2070~2072[研究简报]蛋白A连续床亲和毛细管色谱柱的制备及性能考察潘再法1莫卫民1吴仁安2罗权舟2叶明亮2邹汉法2(1.浙江工业大学化工学院杭州310014;2.中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011)关键词亲和色谱法;连续床毛细管色谱柱;蛋白A;人免疫球蛋白G中图分类号O657文献标识码A文章编号0251-0790(2002)11-2070-03人免疫球蛋白G(HIgG)是一种重要的生物大分子是人血浆中的主要成分

2、之一通常采用免疫学的方法测定.蛋白A(ProteinA)与免疫球蛋白(HIgG)的FC区之间具有很强的特异性亲和作用因而固载蛋白A的亲和介质可用于免疫球蛋白及单克隆抗体的分离~纯化和分析测定[1~3].根据固定相存在形式的不同毛细管色谱柱主要有开管~填充和连续床柱3种方式.连续床具有相比高~易制备(一步合成)~孔径易控制~不需烧塞子和易改性等优点.连续床与其它常用的亲和介质(如球型凝胶颗粒~灌流色谱基质[4~5][67]等)相比具有合成过程简单柱压低和传质速度快等优点可用于生物大~膜介质分子的快速分离[89].本文选用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体亚乙基二甲基丙烯酸

3、酯(ED-MA)为交联剂原位聚合制得含有11个碳原子间隔臂和不含间隔臂的蛋白A连续床亲和毛细管色谱柱.用不含间隔臂的蛋白A色谱柱测定了人血浆中人免疫球蛋白G(HIgG)的含量.利用毛细管电泳仪的压力系统初步实现了快速检测的微型化和自动化.1实验部分1.1仪器与试剂Agi1ent毛细管电泳仪Waters510液相色谱泵毛细管购自河北永年光导纤维厂蛋白A和HIgG均购自Sigma公司人血浆购自大连妇产医院其它化学试剂均为分析纯.1.2色谱条件毛细管色谱柱(32CmX200lmi.c.)有效长度分别为8.5Cm和2Cm;流动相为50mmo1/L磷酸缓冲液[含0.15mo1/LN

4、aC1(pH=7.0上样液)和0.2mo1/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH=2.3洗脱液];进样前先用上样液平衡柱子3min进样后先用上样液冲洗2.5min再改用洗脱液冲洗实验所加压力为1MPa.快速测定时进样后上样0.3min再用洗脱液冲洗所加压力为1.2MPa.检测波长为280nm.1.3亲和毛细管色谱柱的制备(1)将含有适当比例GMA~EDMA~十二醇~环己醇以及适量引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)的混合溶液通氮气除氧15min后用注射器注入毛细管柱中至合适长度用硅橡胶密封两端恒温至反应完成.将毛细管色谱柱与液相色谱泵连接用甲醇冲洗2h以除去致孔剂及其它可溶性化合物.(2

5、)将合成好的基质直接水解再用新配制的高碘酸钠氧化最后与蛋白A反应制得不含间隔臂的蛋白A连续床亲和毛细管色谱柱.(3)将合成好的基质先后与己二胺和戊二醛反应最后与蛋白A反应得到含有11个碳原子间隔臂的蛋白A连续床毛细管亲和色谱柱.1.4实验方法(1)非特异性吸附的考察.准确称量牛血清白蛋白(BSA)冻干标准品用上样液配置成1mg/mL溶液在0.3MPa压力下进样0.5min.(2)重复性的考察.将3mg/mLHIgG的标准溶液在0.3MPa0.5min的进样条件下连续进样5次将稀释10倍的血浆样品在同样条件下连续进样收稿日期:2001-07-02.基金项目:国家杰出青年基金

6、(批准号:29725512)资助.联系人简介:邹汉法(1961年出生)男博士研究员博士生导师主要从事生物液相色谱~毛细管电色谱的研究.No.11潘再法等,蛋白A连续床亲和毛细管色谱柱的制备及性能考察2071一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一5次考察峰高的重复性.(3)标准曲线的制作.准确称量~IgG冻干标准品用上样液分别配成3.02.52.01.51.00.6和0.2mg/mL的标准溶液在同样的进样条件下连续进样以峰高对样品浓度作线性拟合得到定量标准曲线.(4)血浆样品的测定.实

7、验前将冷冻保存的血浆样品于室温解冻离心后吸取上清液用上样液稀释10倍在标准曲线的线性范围内用峰高外标法定量.2结果与讨论2.1两种亲和介质非特异性吸附的比较图1为含有己二胺间隔臂和不含间隔臂的两种亲和介质对BSA的非特异性吸附谱图.由图1可见含有己二胺间隔臂的连续床高效亲和色谱柱对BSA有一定的非特异性吸附而不含间隔臂的色谱柱对BSA的非特异性吸附很低在280nm处没有检测到非特异性吸附的BSA.本文所合成的交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯连续床聚合物基质材料虽然也有一定的疏水性但实验结果表明其非特异性吸附很弱.己二胺是较常用的间隔