叶绿体的分离.doc

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1、叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告一、实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。二、实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。通过控制离心力和离心时间等因素，不同的细胞器可以通过阶梯离心的方式得到分离。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管

2、底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。      叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。      荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—

3、定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。      叶绿素吸收的光能主要用于光合作用。多余的能量可能以热的形式散发，也可能以激发光的形式散发。这种激发光就称为叶绿素荧光。叶绿素荧光检测技术作为一

4、种强大的工具，广泛应用于生态学和植物生理学研究。      利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。三、实验用品1.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙 2.器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片 3.材料：新鲜菠菜四、实验步骤1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于15

5、0ml0.35mol/L    NaCI溶液中，装入组织捣碎机； 2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3-5min； 3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧杯中； 4.取滤液4ml于离心管中，1000r /min下离心2min。弃去沉淀； 5.将上清液取出于另一只离心管中，3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀   即为叶绿体（混有部分细胞核）； 6.将最后一次的沉淀用2-3ml 0.35mol/L氯化钠等渗溶液悬浮； 7.取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可观察。        ①在普通光镜下观察。        ②在荧光显微镜下观察。 8.

6、另取叶绿体悬液一滴滴在载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片   后即可以在荧光显微镜下观察。五、实验结果显微镜下的菠菜叶下表皮的气孔图像，气孔由两个保卫细胞构成气孔保卫细胞荧光显微镜下观察菠菜叶下表皮气孔气孔光学显微镜下，叶绿体为椭圆形叶绿体荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为火红色，呈斑状分布，其他部分为黑色叶绿体吖啶橙染色后荧光显微镜下，叶绿体可发出桔红色荧光，绿色荧光则为细胞核碎片叶绿体细胞核碎片六、分析与讨论1、在离心时，转速不能过高或不能离心过长的时间，否则叶绿体也会破碎，所以要控制好离心的速度和时间。2、在使用荧光显微镜观察时，不能过早的用吖啶橙染色，在

7、观察前染色，在荧光观察时应抓紧时间，先拍照，再观察，因为激光照射部分的叶绿体会逐渐失去荧光。3、叶绿体经激发光波照射后，自发荧光呈现火红色。因叶绿体在其悬液中呈现点状均匀分布，且悬液其他组分无自发荧光反应，故观察到斑状分布的火红色荧光效果。4、叶绿体次生荧光的来由，橘红色为叶绿体的荧光效果，叶绿体的悬液中混有的细胞核碎片经吖啶橙染色荧光反应呈现绿色。