微生物遗传育种实验-.ppt

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1、微生物遗传育种实验-氨基酸营养缺陷型突变株的筛选一、目的要求了解营养缺陷型突变株选育的原理。学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。二、基本原理营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已

2、广泛使用营养缺陷型菌株。三、实验材料1）菌种：细菌12992）培养基：细菌完全培养基；细菌基本培养基无氮基本培养基；2倍氮源基本培养基3）仪器：台式离心机、恒温培养箱、电炉等四、实验步骤（一）培养基制备、细菌对数期培养1.配制培养基：每组的配量肉汤培养基：100ML取10ML分装2支小试管，包扎，灭菌。完全培养基：在剩余的90ML肉汤培养基中加入琼脂，装入三角瓶中，包扎，灭菌。无氮培养基：100ML取10ML分装2支大试管，包扎，灭菌。2倍氮培养基：在剩余的90ML无氮培养基中加入0.2%（NH4）2SO4，

3、装入三角瓶中，包扎，灭菌。生理盐水：100ML注：配方见《微生物实验讲义》69页。2.做对数期培养：取一支肉汤培养基，接入1299，于30度下培养24小时。（二）制备菌悬液、紫外线诱变1.离心洗涤菌体：将对数期培养的菌液，进行2500转/分离心5分，倒掉上清夜，加入5ML生理盐水振荡混匀后，再进行一次离心。2.配制菌液和诱变：菌液：在离心后的菌体中加入生理盐水，振荡混匀后，倒入无菌平皿中，加入生理盐水，使总液量达到10ML。诱变：在30厘米处，用15W紫外灯照射菌液40秒后，置于暗处2小时。中间培养：取诱变后的菌液

4、1ML，加入5ML肉汤培养基中，32度培养。（三）淘汰野生型菌株1.无氮、二倍氮培养：将菌液离心洗涤后，加入5ML无氮培养基中，饥饿培养2小时后，加入2氮培养基中再培养2小时，恢复野生型的生长。2.青霉素杀死野生型：加入200U/ML的青霉素1ML，于30度下培养。（四）涂CM平皿、培养突变型1.倒CM平板：融化完全培养基，倒2个平板。2.稀释和涂CM平皿：将培养液进行10-1、10-2稀释剃度，各吸取0.1ML分别接入2个平板，进行培养。（五）检出缺陷型1.倒CM、MM平板：融化CM、MM培养基，各制备一个平板。

5、在平板下贴好画有20个小格的纸。2.用逐个检出法检测用牙签挑取20个长势良好的菌落，先接在MM培养基的一个位点上，再接CM培养基的相应位点上。32度培养48小时。（六）测定生长谱1.制备MM平板在培养皿底部划分5个区域，做好标记2.将可能是营养缺陷型的菌株，制备菌悬液，接种于平板上。3.在相应的区域加入不同的氨基酸组，进行培养。（七）鉴定缺陷型观察菌的生长情况，确定氨基酸缺陷型。组别1组氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸亮氨酸甘氨酸2346五、试验结论得出结论，分析实验中遇到的问题。进行考试。