微生物遗传与育种实验

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1、微生物遗传与育种实验何琳燕生科楼C7012Tell:84395125Email：hlyan0974@sohu.com实验目的掌握微生物遗传与育种的相关研究技术：诱变、杂交、转化、性状检测、遗传分析等将遗传学知识与育种技术相结合，达到具备独立进行遗传学实验设计、微生物育种技术路线设计与现代微生物分子遗传技术操作能力的目标。实验内容多糖产生菌突变株的筛选和鉴定根瘤菌多糖产量鉴定根瘤菌抗生素抗性检测和突变株筛选两亲本杂交电转化杂交子鉴定技术路线多糖提取测定出发菌株抗性测定杂交子鉴定电转化两亲本杂交杂交子筛选出发菌株

2、抗性诱变时间安排时间内容备注第十周实验内容安排，部分培养基、抗生素配制第十一周根瘤菌多糖产量鉴定根瘤菌抗生素抗性检测课间观察结果第十二周根瘤菌抗药性诱变大肠杆菌质粒DNA提取课间观察结果第十三周两亲本杂交课间观察结果第十四周电转化课间观察结果第十五周杂交子鉴定课间观察结果第十六周提交实验报告分组安排培养基配制TY培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，CaCl20.3g，水1000ml，pH7.0。杂交用，250ml液体/500ml三角瓶，每组2瓶。诱变用，250ml固体/500ml三角瓶，每

3、组2瓶。抗性测试用，50ml固体/250ml三角瓶，每组2瓶。蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖10.0g，酵母膏4.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，钼酸钠（0.5%溶液）4.0ml，硼酸（0.5%溶液）4.0ml，碳酸钙5.0g，水1000.0ml，pH7.2-7.4。多糖测定用，250ml/500ml三角瓶，每组4瓶。LB培养基（培养大肠杆菌）：胰蛋白胨10g，NaCl5g，酵母膏10g，水1000.0ml，pH7.2。质粒提取用，试管装5ml，每人2支。杂交用，50ml液体/

4、250ml三角瓶，每组1瓶。生理盐水：一、根瘤菌多糖产量鉴定实验步骤：摇瓶发酵（实验准备）：200ml蔗糖酵母膏培养基/500ml三角瓶（10瓶），接种振荡培养36h。观察多糖产量：粘稠离心：8000rpm离心10min，收集上清液酒精沉淀多糖：在上清液中缓慢加入等体积95%乙醇，沉淀多糖干燥称重：8000rpm离心10min，收集沉淀，60℃鼓风烘干，称重。二、根瘤菌抗生素抗性检测实验步骤：配制含抗生素TY培养基（氯霉素5μg/ml，利福霉素5μg/ml）；接种：斜面→平板；培养36h后观察生长情况，确定根

5、瘤菌抗药性。结果：菌落生长，说明？三、用梯度平板法筛选根瘤菌抗药性突变株1、制备菌液2、紫外线诱变3、增殖培养（黑暗下操作）4、制备梯度培养皿5、涂布菌液6、抗药性的测定三、两亲本杂交实验步骤：菌体培养（实验准备）：根瘤菌：TY培养基5ml试管，接种，培养20h大肠杆菌（pSC123）：LB培养基5ml试管，接种，培养18h离心：8000rpm离心2min，收集菌体沉淀，用无菌水重悬，再次8000rpm离心2min，收集菌体沉淀，用TY培养基1000μl重悬。杂交：分别取200μl根瘤菌和E.coli菌悬液混

6、合，加1000μlTY培养基，静置24h后涂布选择性平板筛选杂交子。选择性平板：无氮培养基（Kn50μg/ml，Rif50μg/ml）挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。四、电转化实验步骤准备工作：①制备选择性平板TY培养基（Kn100μg/ml，Rif100μg/ml）。②提取要转化的质粒DNA，miniTn5。③制备根瘤菌菌悬液。转化：在电转化用的石英样品杯、质粒DNA、TY培养基、根瘤菌菌悬液50μl按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取200-1000µl、20-100µl、0.5-10

7、µl移液器到超净工作台上。先用0.5-10µl移液器取2µl质粒DNA到根瘤菌细胞内，再用调节到50µl的（20-100µl移液器）上下吹吸数次。在冰上放置2min。用调节到50µl的（20-100µl移液器）将质粒DNA和细胞混合液转移到电转化石英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置1-2min。先用纸将样品槽擦拭一下，移到2kV电脉冲发生器上，同时用1000µl移液器吸好TY培养基1ml，约4.5-5sec后鸣叫声停后，立即加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。培养：将细胞悬浮液从样品槽中

8、取出并加入1.5ml离心管中，在28℃，200/min振荡培养1h。在样品槽中加满自来水，以便清洗。将培养后的转化菌悬液在超净工作台上全部倒入1.5ml微量离心管，12000rpm离心30s（或到达13000rpm后离心15s）。用1000µl移液器取出大部分的上清，再用50µl移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取100µlTY培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。取重新悬浮后的转化根瘤菌30µl加