细菌鉴定技术-临床微生物学和微生物学检验.ppt

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1、细菌鉴定技术南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：4学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：2人实验目的和要求掌握鉴别细菌常用生化反应的原理和结果判定。熟悉鉴别细菌常用生化反应的培养基、方法和意义。熟悉数字编码鉴定技术的原理和结果判断。了解细菌数字编码技术操作和临床意义。实验内容生化反应培养基的制备。常用细菌生化反应。数字编码鉴定。一、生化反应培养基的制备不同生化反应需选择不同生化反应培养基。按相应培养基配方及配制要求，制备所需生化反应培养基。

2、制备方法同培养基制备技术二、常用细菌生化反应糖发酵试验吲哚试验（靛基质试验）甲基红试验V-P（Voges-Proskauer）试验枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验克氏双糖铁（KIA）复合试验动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验1.糖发酵试验【原理】：各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别细菌。【方法】：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种葡萄糖、乳糖发酵管，35ºC培养18-24h观察结果。1.糖发酵试验【结果

3、】：首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊状：1）不分解糖，培养基顔色与接种前无变化，以“-”表示；2）分解糖产酸不产气，培养基由紫色变为黄色，以“+”表示；3）分解糖产酸产气，除培养基顔色变化外，倒管中还有气泡，以“⊕”表示。2.吲哚试验（靛基质试验）【原理】：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与吲哚试剂形成红色化合物。【方法】：大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，35ºC18-24h后，加入吲哚试剂数滴，静置分层，观察结果。【结果】：在培养物液面上层呈玫瑰

4、红色为阳性，不变色者为阴性。3.甲基红试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨水培养基中，35ºC18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察结果。【结果】：红色为阳性，黄色为阴性。－+4.V-P（Voges-Proskauer）试

5、验【原理】：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反应。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，35ºC，24-48h，加入VP试剂甲液和乙液各1滴，充分摇动，观察。【结果】：红色为阳性，若为阴性应再培养4h观察，仍无红色者为阴性。－+5.枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验【原理】：当细菌可以利用铵盐作

6、为唯一氮源，同时柠檬酸盐为惟一碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色为阳性，培养基不变色（绿色）为阴性。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于柠檬酸盐培养基中，35ºC，24-48h，观察。【结果】：菌苔出现，培养基变为深蓝色为阳性。细菌不能生长，培养基不变色（绿色）为阴性。6.克氏双糖铁（KIA）复合试验【原理】：该培养基用酚红指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖和葡萄糖而产酸产气，则斜面与底层均呈黄色，且有气

7、泡。如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层由于是在相对缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化挥发而保持黄色。如细菌分解蛋白产生硫化氢，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。6.克氏双糖铁（KIA）复合试验【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底层穿刺，上层斜面划线），35ºC，24h，观察。【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和底层均呈黄色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，则底层变黄，

8、上层仍为红色。如底层变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁沉淀。双糖铁培养基标准管痢疾杆菌KA－－伤寒杆菌KA－＋大肠杆菌AA＋－7.动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验【原理】：培养基为含尿素、蛋白胨的半固体培养基，指示剂为酚红。具色氨酸酶的细菌能分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚会变红；具脲酶的细菌能分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色；有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。【方法】：将大肠埃希菌和普通变形杆菌穿刺线接种于MIU培养基，35ºC，18-