利用改良的氨基酸测定方法检测野生红小豆（Vigna angularis）品系氨基酸含量-论文.pdf

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1、第4l卷第3期江汉大学学报(自然科学版)Vo1．41NO．32013年6月J．JianghanUniv．(Nat．Sci．Ed．)Jun．2013利用改良的氨基酸测定方法检测野生红小豆(Vignaangularis)品系氨基酸含量彭海，张静，陈禅友(江汉大学系统生物学研究院；湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心，湖北武汉430056)摘要：传统的氨基酸测定方法有液相色谱法和比色法。前者仪器与试剂都较贵，后者便宜，应用更为广泛。但比色法操作都在毫升级别上进行，所需液体体积较大，操作不方便，实验条件控制不精确，结果误

2、差较大，也无法实现自动化，不利于食品安全抽查等工作。本研究将传统比色法的操作体积减少到微升级别，并且在PCR仪中实现了反应条件的自动化控制，结果精度大大提高，成本大为降低，也有助于实现自动化。利用改良的方法，对10个筛选红小豆品系的氨基酸含量进行了检测，发现所筛选的10个红小豆的氨基酸含量平均值在222．95～191．53Ixg／g之间，且存在显著变异，为红小豆氨基酸含量育种改良奠定了良好基础。关键词：氨基酸测定；比色法；红小豆；改良中图分类号：$521．037文献标志码：A文章编号：1673．0143(2013)

3、03．0074．04红小豆又名红豆、赤小豆或赤豆，其具有降的氨基酸含量，为育种选择奠定了基础。低胆固醇n。、调节人体雌激素水平、用作中草1实验部分药等功能，用途十分广泛。红小豆起源于我国，资源十分丰富。本研究在武汉市蔡甸区洪北1．1材料乡胜洪村发现了一个野生红小豆种群，并对其进10个初步筛选的野生红小豆品系，分别编号行了表型性状调查，发现在色泽、种子大小、株为s1～s10，于2012年在海南统一繁殖获得种子。高等方面存在明显变异。经过分株单选，从这1．2仪器个野生红小豆种群中获得了10个品系。全波段超微量分光光度计

4、(QuanWell，红小豆含有超过20％的蛋白质和各种氨基Q5ooo型)；PCR仪(ABI，2700型)；恒温金属浴酸，人体必须赖氨酸含量也较高，因此，氨基酸(MiniT一100，杭州奥盛仪器有限公司)。含量是红小豆品质的一个重要指标。虽然传统的1．3试剂红小豆测定方法有液相色谱法和比色法两种方3％茚三酮试剂、氰酸盐缓冲液、标准氨基法，但前者设备与试剂费用都较高，难以大量推酸、0．3％抗坏血酸溶液。广，而后者操作所需要的液体体积较大，比较粗1．4标准曲线的制备放，误差较大，也难以实现自动化与批量处理。取0．2mLP

5、CR管18支，按表1加入各试剂，为此，在本研究中，对传统的比色法测定氨基酸震荡混匀，在PCR仪中100℃保温12min，取出含量进行了改良，使操作体积缩小到微升级别，后立即置冰上，于每支PCR管中加入150L95％使操作方便程度大大提高，结果精度也显著改乙醇，震荡混匀，使加热时形成的红色产物被氧善，同时降低了成本，也有助于自动化操作。利化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下用改进的方法，测定了所筛选的10个红小豆品系测其光密度(以空白管为参比)，以氨基酸浓度为收稿日期：2013—05—22基金项目：武汉市科

6、技攻关项目(2013021001010465)；湖北省豆类中心项目(2012—02)作者简介：彭海(1975一)，男，讲师，博士，研究方向：园艺与遗传学。通信作者：陈禅友(1963一)，男，教授，研究方向：植物遗传学与育种。E-mail：ccy@jhun．edu．cn2013年第3期彭海，等：利用改良的氨基酸测定方法检测野生红小豆(oangularis)品系氨基酸含量75横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出1．7数据分析直线方程。游离氨基酸含量=1．5样品制备C×V×14C×l500×142W×1000W×1

7、000取30个1．5mL的EP管，称量空管的重量，式中，c为由直线方程计算的值，即氨基酸浓度选取S1～S10红小豆各3粒，分别置于30个EP管(nmol／~L)；V为样品提取液经稀释后的总体积中，用带研磨杵的电钻将样品研磨成粉状，再称(L)=1500L；W为样品重(g)。量各EP管重量，减去空管的重量，即为加入红小豆的重量。向EP管中加蒸馏水1mL，于恒温金2结果与分析属浴100℃加热20min以提取游离氨基酸，之后2．1氨基酸标准曲线置冰上冷却，1000r／min离心1min，取上清于另采用超微量分光光度计进行吸

8、光度值的测一干净的1．5mLEP管中，恒温金属浴上100qc定，由于最后测定只需要1L的量。因此，在制加热10rain，用水补至1．5mL。定标准曲线时，各反应组份体积都控制在l5L1．6样品测定以内，测定结果见表1。从表1可以看出：标准品取33支PCR管，其中30支分别加入S1～S10的吸光度变异较小，均不超过0．0002，表明改进的提取液5L，另外3支加