自噬体的检测.doc

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1、自噬体的检测①电子显微镜检测：电子显微镜检测形态学超微结构被认为是检测自噬体的金指标。在透射电镜下可见未消化的胞浆成分或损伤的细胞器（如线粒体、内质网片段等）周围出现空泡状双层膜样结构，随后双层膜环绕并封闭形成自噬体，然后与溶酶体融合，变成单层膜结构，其中含有降解不同阶段的胞浆成分。一般来说，降解物的电子密度会增加，形成黑色颗粒状或不定形的聚集，因此也能够辨认。②吖啶橙（AO）、丹酰戊二胺(MDC)染色法：吖啶橙（AO）染色法是利用对pH敏感的原理标记酸性囊泡细胞器结构。AO是一种具有细胞渗透性的荧光染色方法，可以染色DNA和胞质为亮绿色。AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，当

2、pH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过流式细胞仪或者在荧光显微镜下观察到。丹酰戊二胺(MDC)染色法也是一种常用的酸性细胞器标记技术，但有研究发现MDC荧光信号主要集中于核周，而自噬体结构一般散在分布于细胞质。说明其并不是一种好的自噬体标记物。③自噬体膜标志性蛋白质的检测：自噬体膜上标志性蛋白质有ATGl2-ATG5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。ATGl2和ATG5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母ATG8的哺乳动物同源蛋白微管相关轻链蛋白3，LC3

3、是目前最明确贯穿整个自噬过程并能出现在晚期自噬溶酶体中的自噬相关蛋白，细胞内合成LC3后，新生LC3的C末端即被ATG4加工生成LC3-Ⅰ，自噬激活时，LC3-Ⅰ在泛素样反应酶的作用下与磷脂酰乙醇胺偶联生成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ定位于胞质内，LC3-Ⅱ定位于自噬体的内外膜。通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成ATGl2-ATG5-GFP、LC3-GFP，即可实现对自噬体的检测。也可以通过免疫印迹法检测其表达水平，以反映自噬体的数量。④自噬降解底物检测：自噬系统对底物有特意选择性，最为广泛的自噬降解底物包括p62/sequestosome-1（SQSTM1，一种泛素样结合蛋白）及长寿命蛋白。

4、前者偶联于微管相关蛋白轻链3，作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬的中晚期被降解。后者在体内被降解主要通过自噬作用。