巨自噬检测方法的研究进展

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1、巨自噬检测方法的研究进展刘志友1邹腊梅2杨思进（指导）白雪3（1、2泸州医学院四川泸州646000;3泸州医学院附属中医医院四川泸州646000）【摘要】细胞自噬（Autophagy}"是近十年来继"细胞凋亡（Apoptosis）之后，当前研宄之热门［1］，木文将对近年来细胞巨自噬的检测方法进行综述。【关键词】自噬检测自噬体Ic3beclinel【中图分类号1R329.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）02-0048-01细胞自噬是一个多阶段、多基因参与调控的细胞生理过程［2］。是细胞通过自身形成的自噬囊泡，吞噬胞浆内变性蛋白质和细胞器，

2、通过微管相关蛋白,以动力依赖性的方式转运至溶酶体降解的过程,它有别于坏死，也不同于凋亡（三者均为细胞蛋白降解的途径）。自噬囊胞由双层被膜覆盖，其起源目前并不清楚。根据发生自噬的机制不同，哺乳动物细胞自噬主要毡括巨自噬，小自噬和分子伴侣介导自噬。自噬囊胞内容物被其所毡裹的膜性结构带至溶酶体后，均发生膜的迅速降解，进而释放出其中的底物，使溶酶体中水解酶对底物进行有效水解，保证了细胞对底物的再利用。通过自噬性细胞死亡，组织实现对自身细胞周期的精密调节，对自身生长发育起重要作用［3］。研究细胞自噬（Autophagy）成为近

3、•年来继细胞凋亡（Apoptosis）之后当前

4、研究之热门，木文将对细胞巨自噬的检测方法进行综述。1自噬形成的稳态监测1.1Phagophore、autophagosome（自噬体）及autolysosome（自噬溶酶体）数量细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，扁平状，就像一个由两层脂双层组成的碗，称为“Phag叩hore”，是自噬发生的铁证之一。属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，需在透射电镜下观察（透射电子显微镜下超微结构的形态学检测为检测自噬体的金指标）。其特征为新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。“Phagophore”不断延伸，将胞浆中的

5、任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的“autophagosome（自噬体）”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。自噬体的检测对研究自噬尤为重要，而对其特征，专家们冇不同的意见［4】，但为双层或多层膜的液泡状结构（比如饥饿诱导的自噬），内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等［5］。自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮池和内体融合，自噬体与溶酶体融合形成“autolysosome（自噬溶酶体）”，其特点为单层膜，胞浆成分己降解。期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、

6、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。1.2自噬体膜标志性蛋白质的检测1.2.1LC3-II蛋白水平自噬的形成过程主要依赖自噬相关基因（autophagy-relatedgene,atg）和微管相关蛋白-3（LC-3）两条途径形成，其中以atgl2为主的atg系统主要参与前自噬泡形成，LC-3系统主要参与自噬泡修饰。其中LC-3正常情况下主要存于胞浆中，叫LC-3I，在自噬发生过程中，LC-3I通过自身修饰而截短与自噬泡膜结合。由于LC-3I和LC-3II分子量上的差异性，可在免疫印迹杂交中形成两条不同条带，通过观察LC-3

7、I和LC-3II比值的变化以评价自噬形成：自噬形成吋，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II）,因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。冋吋检测人类atg-6（又叫beclin-1）也是一种常用的自噬观测手段［6】。1.2.2LC3（或Atg8）斑点自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3（LC3）。Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因（Apg7/Apg8）［7］在哺乳动物中的同源物，和

8、前者相比，LC3除了定位在自噬体分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上，在自噬溶酶体膜上可见，通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP,即可实现对自噬体的定量检测［8］。由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring)自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成［9】。无自噬吋，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成吋，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明

9、亮的绿色荧