粪菌移植对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障的保护.ppt

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1、粪菌移植对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障的保护导师：武华学生：程巩选题依据国内外研究现状及创新研究方案研究计划及预算选题依据粪菌移植炎症性肠病肠粘膜屏障粪菌移植粪菌移植(fecalmicrobiotatransplantation，FMT)是将健康人粪便中的功能菌群移植到菌群分布异常的患者胃肠道内，重建其健康的菌群分布结构，实现肠道及肠道外疾病恢复的一种治疗方式。在世界医学史上至少始于公元4世纪，但是直到近几年才得到了恢复的一种治疗方式。FMT在现代医学中的概念包括4个层面的含义：(1)从健康捐赠者粪便中分离功能菌群；(2)移植到患者消化道；(3)重建患者肠道菌群状

2、态；(4)目的在于治疗肠内外疾病。炎症性肠病炎症性肠病inflammatoryboweldiseasesIBD是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性疾病包括溃疡性结肠炎ulcerativecolitisUC和克罗恩病Crohn'sdiseasesCD。近年来发病率呈逐年上升趋势其病因和发病机制尚不明确，与遗传环境微生物免疫等多种因素密切相关。肠粘膜屏障肠黏膜是机体中一处最大的黏膜表面,它不但是营养物质消化吸收的重要场所，同时也是人体最大的细菌储存器官和病原微生物、毒素侵入机体的主要门户。肠黏膜屏障是指由机械屏障、生物屏障、免疫屏障等组成的一个复杂而又庞大的立

3、体防御体系，其主要作用是能够有效地阻止肠道内的有害物质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环，使机体内环境保持相对稳定, 维持机体的正常生命活动。当各种原因引起肠黏膜损伤、萎缩、肠道通透性增加或肠道菌群失调时，就容易导致肠道细菌易位和(或)肠源性内毒素血症，从而诱发或加重全身炎性反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)或引起多器官功能衰竭(multipleorganfailure,MOF) 形成恶性循环。近期的研究表明：炎性肠病（IBD）病人肠黏膜对肠道内共生菌群不恰当的免疫反应是导致

4、疾病发生发展的重要原因之一。尽管还没有确定哪一种菌对肠黏膜免疫屏障有影响，但目前的研究发现IBD病人肠道内菌群的数量和丰度都较正常人低国内外研究现状及创新之处近年来FMT在治疗复发性肠道艰难梭状芽孢杆菌感染中取得了很好的疗效。因此，国外相继开始采用该方法治疗IBD。但粪菌移植治疗炎症性肠病的研究目前正处于起步阶段，尚需逐步开展针对粪菌移植治疗对照研究提供更有力的依据，因此开展粪菌移植在治疗炎症性肠病中应用的研究具有深远的现实意义。本课题旨在评价粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清DAO及D-乳酸影响，研究其对大鼠肠粘膜屏障的保护作用。从而为进一步临床应用提供依据。国

5、内外研究现状及创新之处现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性CDI和IBD的个案或系列病例报道,但FMT导致患者肠道菌群具体发生何种有益变化及其潜在的机制仍不完全清楚。本实验在于研究粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜屏障的保护作用，此项研究目前鲜有报道。研究方案BECDA实验分组建立模型干预措施预期成果技术路线实验分组健康雄性SD大鼠54只，体重250~300g，随机分为3组：（A）空白对照组（B）模型生理盐水组（C）模型粪菌移植组建立模型大鼠造模前1d禁食24h，不禁水，称重后，3％的戊巴比妥腹腔注射麻醉(或乙醚)，5％2，4，6．三硝基苯磺酸(TN

6、BSW／V)按100mg／kg一150mg／kg(约等于TNBS原液O．4mL～0．6mL相当于200g大鼠20mg～30mg)；分别加入乙醇；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段8cm，注射器注人。再倒立1～5min左右，以防药液溢出，UC一次性灌肠。新鲜粪菌液制备流程：①将供体新鲜粪便样本置于搅拌器中，0．9％NaCl溶液进行初步均质加工（新鲜粪便与0．9％NaCl溶液的比值为1:5）；②将粪便浆体经不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；③冰上转运至实验室并在采集后2h内进行处理；④将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理；⑤浆体逐级经过

7、直径2．0mm、1．0mm、0．5mm和0．25mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；⑥将再次过滤的样本以6000转／min的速率离心15min，并将沉淀再悬浮于0．9％NaCl溶液中，得几乎无色无味的粪菌液。获得的新鲜粪菌液可立即进行移植，也可加入无菌甘油后置于一80℃作为冰冻样本保存1～8周。干预措施三组大鼠按大鼠正常灌肠剂量灌入粪菌移植液及生理盐水。A、B组给生理盐水灌肠；C组给予粪菌移植液。饲养期间,于第3、7、11天3个时间点每组分别取5只大鼠取血测量相关指标，并取肛门以上8cm肠段卷起，置10％中性甲醛中固定，石蜡包埋、切片、H

8、E染色后显微镜下观察。在光镜下观察组织损伤程度并采用