凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点华中农业大学生物化学.pdf

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1、实验六凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点.一实验原理等电聚焦(isoelectricfocusing)又称电聚焦(elcctrofocusing)、聚焦电泳(fousielectrophoresis)等。蛋白质(酶)、多肽等两性电解质，其所带电荷的性质和数量，随所处环境的pH而变化。环境pH低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极移动；当环境的pH等于其等电点时，则不带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳极至阴极，pH由低到高(即

2、环境由酸变碱)的连续而稳定pH梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将据所处环境的pH与其自身等电点的差别，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的pH环境位置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚(聚焦)，分别形成一条集中的蛋白质区带(图41—1)。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分离开的电泳方法称为等电聚焦电泳。电泳后测定各种蛋白质聚焦部位的pH，即可得知它们的等电点。图41-1蛋白质在电场中等电聚焦示意图在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物

3、质是一类两性电解质。它具有依次递变但相差不大的等电点(p1)，在电场中可以形成逐渐递变而又连续的pH梯度。此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以保证不致受蛋白质样品等两性物质对pH梯度的影响；在等电点处还具有足够高的电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦；这类物质还具有不与分离物质反应或使之变性，自身化学性质不同于被分离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。1969年瑞典Vesterberg首先合成这种物质，随即由瑞典LKB公司以Ampholine

4、为商品名供应于市。Ampholine是由多乙烯多胺(如三乙烯四胺、五乙烯六胺等)与丙烯酸(不饱合酸)进行加成反应而生成，是一系列含不同比例氨基和羧基的氨基羧酸的混合物。为无色水溶液，含量为40％，分子量300～1000范围。它的水溶性很好，1％水溶液中的紫外吸收(260nm)很低。商品Ampholine的pH有各种范围，最宽的为pH3—10，测定未知样品的等电点时，首先用Ampholine进行初步测定，根据测得的结果，再选择合适的pH范围较窄的Ampholine进行精确测定。为防止电泳过程中，因为对

5、流现象使已经聚焦的蛋白质区带再昆合，需要一种能抗对流的介质作为电泳支持物。目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度梯度；用琼脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝胶及利用亲水惰性颗粒，如葡聚糖凝胶、淀粉、滤纸等为支持剂，以凝胶作支持物的称为凝胶聚焦电泳，这种方法适用于分析分离。其他支持剂适用于制备。等电聚焦电泳的优点在于(1)分辨率高，可将等电点相差0.01—0.02pH单位的蛋白质分开。(2)不像一般电泳易受扩散作用影响，使区带越走越宽；聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。(3)由于等电聚焦的作用，很稀的

6、样品也可以聚焦而浓缩。(4)因为是根据等电点特性分离，所以重复性好，精确度高，可达0.01pH单位。其不足之处在于：(1)要求样品溶液无盐，因为盐会增大电流量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。(2)要求样品成分在等电点时稳定，不适宜用于在等电点时不溶解或变性的蛋白质。等电聚焦电泳具有分离、制备及鉴定蛋白质、多肽的多种功能。本实验以柱状凝胶等电聚胶等电泳法测定牛血清清蛋白质的等电点，以掌握等电聚焦电泳的操作方法。.二试剂及器材(1)两性电解质Ampholine(瑞典Pharm

7、acia公司新产品，称为Pharmalyte)Ph3-10，浓度40％。(2)丙烯酰胺溶液：称取丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1.0g，用蒸馏水溶解后定容至100ml，过滤，4℃贮存。(3)TEMED。(4)1.0％过硫酸铵溶液：临用时配制。(5)正极缓冲液：0.2％(V／V)硫酸或磷酸。(6)负极缓冲液：0.5％(V／V)乙二胺水溶液。(7)固定液：10％(W／V)三氯乙酸。(8)染色液：考马斯亮蓝R2502.0g以50％甲醇1000ml溶解。使用时取93m1，加入7.0ml冰

8、醋酸，摇匀即可使用。(9)脱色液：按5份甲醇、5份水和1份冰醋酸混合即可。(10)牛血清清蛋白(生化试剂)，配成10mg／mI的水溶液。(11)电泳仪：100mA，600V。(12)圆盘电泳槽。（13）玻璃管：内径5cm，长80-100cm(14)微量进样器(100μl)，(15)7号(长10cm)针头和注射器。（16）聚焦指示剂：肌红蛋白(pI=6.7)、细胞色素C(pI=10.25)或甲基红染料(pI=3.75)（17）蛋白质等电点标准.三操作1.凝胶制备按表1的