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1、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳一、实验简介1、实验目的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验，初步掌握聚焦电泳的基本原理和实验技术2、基本原理2.1蛋白质的等电点蛋白质属于一种两性电解质.在不同的pH环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时的pH为该蛋白质的等电点。在电场下不泳动。2.2.等电聚焦在常规电泳中,通常只是在恒定的缓冲液中进行分离，假定有A,B两个蛋白质组分，分别带有净电荷-3和+1。在一个pH9的缓冲洗脱中,带负电荷的蛋白质均放在靠阴极一侧电泳,此时带负电荷多的A蛋白质受阳极影响大,泳动速度比B快,最终会超过B，这样二者就会得到分离。在等电聚焦电
2、泳中，分离是在连续的pH梯度中进行的。如果把A,B二者的混合物放在一个pH3.5-10的pH梯度中的pH6的位置，则A蛋白质的净电荷为-2,减少两个净电荷；B蛋白质的净电荷为+2，多了两个净电荷。在相同的电场下,A移向阳极,B移向阴极，当它们达到净电荷为零时停止迁移，这种行为称为聚焦反应。蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，这是一个”稳态”过程,一旦达到等电点的位置，蛋白质就会停止迁移。达到稳态后，如果它要正极或负极任何一侧扩散，均会受到相应的pH制约，即若向负极扩散带负电,会受到阳极的影响，迫使其扩散后退回原位;若向正极扩散带正负电,会受到阴极的影响，迫使其扩
3、散后退回原位。因此，蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄带。2.3.两性电解质(1)Ampholine(瑞典LKB)它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的,pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.(2)Servalyte(德国Serva公司)它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的.pH范围:2-4,3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.(3)Pharmalyte(瑞典Pharmacia)七氨基多羧基组成的pH范围:2.5-5,4-5.5,5-8,8-1
4、0,3-10等(4)载体两性电解质(军事医学科学院)合成的方式与Ampholine基本相同.pH范围:3-9.5,3.5-5.5,4.0-6.0,5.0-7.0,6.0-9.0,7.0-10.03pH梯度的形成3.1在电场下载体两性电解质的变化在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零.引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移.(1)靠近阳极端的载体两性电解质,
5、电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延;(2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阳极顺延。如图3.2pH梯度的形成过程pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图4、实验流程等电聚焦凝胶溶液配制↓安装电泳槽、调水平↓铺胶↓加样↓电泳↓停止电泳↓取胶固定↓染色、脱
6、色二、实验方法1、仪器准备及清洗(1)电泳槽,玻璃板三块,塑料模板(2)烧杯50ml一个(3)量筒100ml一个10ml一个(4)大培养皿一个2、配试剂(每组用量)（1）固定液100ml三氯乙酸10g磺基水杨酸3.5g95%乙醇35ml加蒸馏水至100ml(2)脱色液100ml95%乙醇10ml冰醋酸7.5ml加蒸馏水至100ml3、实验步骤(1)安装电泳槽,调水平(先平放两块相同厚度玻璃板,上放塑料模板,一头用铁夹夹住)ABCDE(2)配凝胶溶液单体2mlAmpholine0.5mlddH2O5.5mlTEMED8μl10%AP50μl(3)灌胶,聚胶60分钟(4)取下玻
7、璃板,电泳槽上加少许液体石蜡,将坐标纸浸透铺平整,坐标纸上放带胶玻璃板(5)加电极条:取4张滤纸条,其中两张滤纸条浸透1mol/L磷酸,另两张浸透1mol/LNaOH,多余的液滴用滤纸质吸去,然后对称放在凝胶的两侧.(6)剪取加样纸:按坐标纸的尺寸,剪成0.5x0.5cm大小的加样纸,拨去上下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层).(7)加样:将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的凝胶中央.(8)连接电极:将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上
